Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos
Summary
Aquí presentamos un método experimental para probar el papel de multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos.
Abstract
Multicopy plásmidos son extremadamente abundantes en procariotas pero su papel en la evolución bacteriana sigue siendo mal entendida. Recientemente demostró que el aumento en el número de copias del gen por celular proporcionado por plásmidos multicopy podría acelerar la evolución de los genes codificados por el plásmido. En este trabajo, presentamos un sistema experimental para poner a prueba la capacidad de multicopy plásmidos para promover la evolución del gene. Utilizando métodos de biología molecular simple, construimos un modelo de sistema donde puede insertarse un gen de resistencia a los antibióticos en MG1655 de Escherichia coli , en el cromosoma o en un plásmido de multicopy. Utilizamos un enfoque experimental de la evolución para propagar variedades cada vez más las concentraciones de antibióticos y medimos la supervivencia de las poblaciones bacterianas en el tiempo. La elección de la molécula del antibiótica y el gen de resistencia es para que el gen sólo puede conferir resistencia a través de la adquisición de mutaciones. Este enfoque de “rescate evolutivo” proporciona un método simple para probar el potencial de multicopy plásmidos para promover la adquisición de resistencia a los antibióticos. En el paso siguiente del sistema experimental, se caracterizan las bases moleculares de resistencia a los antibióticos. Para identificar las mutaciones responsables de la adquisición de resistencia a los antibióticos utilizamos profundo secuenciación del ADN de las muestras obtenidas de clones y poblaciones enteras. Finalmente, para confirmar el papel de las mutaciones en el gen objeto de estudio, reconstruir en el fondo los padres y el fenotipo de resistencia de las cepas resultantes de la prueba.
Introduction
Resistencia a los antibióticos en las bacterias es un problema de salud importante1. A un nivel fundamental, la propagación de la resistencia a los antibióticos en bacterias patógenas es un simple ejemplo de la evolución por selección natural2,3. En pocas palabras, el uso de antibióticos genera selección de cepas resistentes. Un problema fundamental en biología evolutiva, por lo tanto, es entender los factores que influyen en la capacidad de las poblaciones bacterianas para evolucionar la resistencia a los antibióticos. Experimentos de selección se han convertido en una herramienta muy poderosa para investigar la biología evolutiva de bacterias, y este campo ha producido penetraciones increíbles en una amplia gama de problemas evolutivos4,5,6. En la evolución experimental, poblaciones bacterianas desde una única cepa parental son pasadas en serie bajo condiciones definidas y muy controladas. Algunas de las mutaciones que se producen durante el crecimiento de estas culturas aumentan fitness bacteriano, y éstos se propagación a través de las culturas por la selección natural. Durante el experimento, las muestras de las poblaciones se conservan criogénicamente periódicamente para crear un registro fósil congelado no evoluciona. Un gran número de métodos puede utilizarse para caracterizar la evolución de las poblaciones bacterianas, pero los dos métodos más comunes son los ensayos de aptitud, que miden la capacidad de las bacterias evolucionadas para competir contra sus antepasados lejanos y secuenciación del genoma entero, que es utiliza para identificar los cambios genéticos adaptación de la unidad. Siguiendo el trabajo pionero de Richard Lenski y colegas7,8, el enfoque estándar en evolución experimental ha sido desafiar un número relativamente pequeño de las poblaciones de replicar (típicamente < 10) con adaptación a un nuevo desafío ambiental, tales como nuevas fuentes de carbono, temperatura o un depredador fago.
Infecciones causadas por bacterias resistentes a los antibióticos se convierten en un gran problema cuando la resistencia es lo suficientemente alta como para que no es posible aumentar las concentraciones de antibióticos a niveles letales en los tejidos del paciente. Los médicos por lo tanto están interesados en lo que permite que las bacterias desarrollar resistencia a las altas dosis de antibióticos que están por encima de esta concentración antibiótico de umbral, el punto de corte clínico. ¿Cómo estudiar esto experimentalmente? Si un pequeño número de las poblaciones bacterianas se desafió con una alta dosis de antibiótico, como en un estilo de Lenski experimento, el resultado más probable es que el antibiótico todas las poblaciones conduce a la extinción. Al mismo tiempo, si la dosis de antibiótico que se utiliza es baja, por debajo de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la cepa parental, entonces es poco probable que las poblaciones bacterianas evolucionará clínicamente relevantes niveles de resistencia, especialmente si resistencia lleva un costo grande. Un compromiso entre estos dos escenarios es utilizar un “rescate evolutivo” experimento9,10,11. En este enfoque, un gran número de culturas (por lo general > 40) es desafiado con dosis de antibióticos, que aumentan con el tiempo, por lo general duplicando la concentración de antibiótico cada día12. El sello de este experimento es que cualquier población que desarrollan mayor resistencia será conducido a la extinción. Mayoría de las poblaciones que se enfrentan de esta manera se impulsará extinto, pero una pequeña minoría persistirá por altos niveles de resistencia en evolución. En este artículo mostramos cómo este diseño experimental se puede utilizar para investigar la contribución de multicopy plásmido a la evolución de la resistencia.
Las bacterias adquieren resistencia a los antibióticos a través de dos rutas principales, las mutaciones cromosómicas y adquisición de elementos genéticos móviles, mayormente plásmidos13. Plásmidos desempeñan un papel clave en la evolución de resistencia a los antibióticos porque son capaces de transferir genes de resistencia entre las bacterias por conjugación14,15. Plásmidos pueden dividirse en dos grupos según su tamaño y Biología: “pequeño”, con número de alta copia por célula bacteriana y “grande”, con baja copia número16,17. El papel de grandes plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos ha sido ampliamente documentado porque incluyen plásmidos conjugativos, que son motores principales de la difusión de la resistencia y la multi resistencia entre bacterias15. Los plásmidos multicopy pequeños también son muy comunes en las bacterias17,18, y a menudo codifican genes de resistencia a los antibióticos19. Sin embargo, se ha estudiado el papel de los plásmidos multicopy pequeños en la evolución de resistencia a antibióticos en menor medida.
En un trabajo reciente, hemos propuesto que los plásmidos multicopy podrían acelerar la evolución de los genes que llevan por aumento de las tasas de mutación de gen debido al número más alto de la copia del gene por célula de12. Utilizando un modelo experimental con e. coli tensión MG1655 y la β-lactamasa gen blaTEM-1 se ha demostrado que plásmidos multicopy aceleraron la tasa de aparición de mutaciones de TEM-1 que confiere resistencia a la tercera generación cefalosporinas ceftazidima. Estos resultados indicaron que los plásmidos multicopy podrían desempeñar un papel importante en la evolución de resistencia a los antibióticos.
Aquí, presentamos una descripción detallada del método que hemos desarrollado para investigar la evolución multicopy mediada por plásmidos de resistencia a los antibióticos. Este método tiene tres etapas: primera, inserción del gen en estudio o en un plásmido de multicopy o en el cromosoma de la bacteria huésped. En segundo lugar, el uso de evolución experimental (rescate evolutivo) para evaluar el potencial de las cepas diferentes para adaptarse a la presión selectiva. Y en tercer lugar, determinar la base molecular subyacente evolución mediada por plásmido con ADN secuenciación y reconstruyendo las mutaciones sospecha individualmente en el genotipo de los padres.
Por último, aunque el protocolo descrito aquí fue diseñado para investigar la evolución de la resistencia a los antibióticos, se puede argumentar que este método podría ser generalmente útil analizar la evolución de las innovaciones adquiridas por las mutaciones en cualquier MultiCopia genes codificados por el plásmido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos un nuevo protocolo que combina la biología molecular, evolución experimental y profundo secuenciación de ADN diseñado para investigar el papel de multicopy plásmidos en la evolución de la resistencia antibiótica en bacterias. Aunque este protocolo combina técnicas de diferentes ámbitos, todos los métodos necesarios para su desarrollo son simples y pueden ser realizados en un laboratorio de Microbiología regular. Los pasos más críticos en el protocolo son probablemente la construcción de las cepa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + i 2013-2016): otorga CP15-00012, PI16-00860 y CIBER (CB06/02/0053), cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional ” una forma de alcanzar Europa ” (FEDER). JAE es apoyado por el programa de Atracción de talento del gobierno de la región de Madrid (2016-T1/BIO-1105) y el I + D de Excelencia de la Española Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM es apoyado por una beca de investigación Miguel Servet desde el Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) cofinanciado por el Fondo Social Europeo “Invertir en tu futuro” (FSE) y el FEDER.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
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