Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

La barrera blood – brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato – encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular^{1,2,3,4,5 , 6 , 7}. cerebro células endoteliales también sirven como una barrera al tratamiento mediante el bloqueo de la absorción de drogas en el cerebro, por ejemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme tras tumor resección^{8,9, 10}. en este sentido, los capilares del cerebro humano aisladas representan un modelo único ex vivo barrera blood – brain que se asemeja a la barrera propiedades en vivo, que permite el estudio de la función de barrera y disfunción en la salud y la enfermedad. En este artículo, nos proporcionan un protocolo para aislar los capilares cerebrales del cerebro humano con una alta calidad capilar y rendimiento para el estudio de la barrera blood – brain.

En 1969, Siakotos et al. ¹¹ fueron los primeros en informar el aislamiento de los capilares del cerebro bovino y humano de tejido de cerebro usando densidad gradiente centrifugación y vidrio grano columna separación. Más tarde, Goldstein et al. ¹² mejorar este método mediante la adición de varios pasos de filtración para disminuir la cantidad de tejido necesario para el estudio de los capilares del cerebro aislados de ratas, manteniendo la actividad metabólica del transporte de glucosa. Desde entonces, los investigadores optimizan el procedimiento de aislamiento capilar numerosas veces, mejorando el método y el cerebro modelo capilar con cada iteración^13,14,15. Por ejemplo, Pardridge et al. ¹⁶ aislados bovinos capilares mediante digestión enzimática, en lugar de homogeneización mecánica y posteriormente pasa una suspensión capilar a través de un filtro de malla de 210 μm y una columna de bolas de vidrio. Estas modificaciones mejoraron la mancha de exclusión azul de tripano de capilares del cerebro aislado y así, aumentaron la viabilidad de las células endoteliales. En la década de 1990, Dallaire et al. ¹⁷ aislados capilares bovinos y ratas que eran claras de contaminación neuronal y mantener la actividad metabólica de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GTase) y fosfatasa alcalina. En el año 2000, Miller et al. ¹⁸, utiliza aislado de rata y los capilares del cerebro porcino en combinación con la microscopía confocal para mostrar la acumulación de sustratos de transporte en el lumen de los capilares. Posteriormente, nuestro laboratorio ha continuado optimizar el procedimiento de aislamiento capilar cerebral y hemos establecido ensayos de transporte para determinar la P-glicoproteína (P-gp)^19,20,21, cáncer de mama resistencia proteína (BCRP)^22,23y 2 (Mrp2) de la proteína de resistencia a múltiples drogas actividad de transporte de²⁴ . En 2004, hemos publicado dos informes donde utilizamos los capilares del cerebro aislado de rata para investigar diferentes vías de señalización. En Hartz et al. ²¹, se encontró que el péptido endotelina-1 rápidamente reversible reduzca la función de transporte de P-gp en capilares del cerebro, actuando a través del receptor de endothelin receptor B (ET_B), óxido nítrico sintasa (NOS) y proteína quinasa C (PKC). En Bauer et al. ¹⁹, demostramos la expresión del receptor del receptor nuclear pregnano X (PXR) y mostró PXR-modulación de la función de transporte y expresión de P-gp en los capilares del cerebro. En experimentos con ratones transgénicos de PXR humanizados, hemos ampliado esta línea de investigación y mostró en vivo apretando de la barrera por regular P-gp a través de la activación de hPXR²⁵. En 2010, Hartz et al. ²⁶ utiliza este enfoque para restablecer la expresión de la proteína P-gp y transporte actividad en ratones de (hAPP) la proteína precursora del amiloide humanos transgénicos que sobreexpresan hAPP. Además, restauración de P-gp en hAPP ratones redujeron significativamente la amiloide beta (Aβ)₄₀y niveles de Aß₄₂cerebro.

Además de estudiar vías de señalización, los capilares del cerebro aislado pueden utilizarse para determinar los cambios en la permeabilidad capilar que denominamos fuga capilar. En particular, el análisis de fuga de Texas Red se utiliza para evaluar la fuga de colorante fluorescente rojo de Texas desde el lumen capilar con el tiempo y estos datos entonces se utilizan para analizar las tasas de salida. Tasas de fuga capilar aumento en comparación con las de los capilares de control indican cambios en la integridad física de la barrera blood – brain². Esto es valioso porque hay numerosos Estados de enfermedad asociados con la interrupción de la barrera, por ej., epilepsia, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y cerebral traumática lesión^{27,28,29, 30}. Otros grupos también han utilizado los capilares aislados para discernir las vías de señalización que regulan la expresión de la proteína y la actividad de transporte de proteínas^{31,32,33,34, 35,36,37}. Por último, hemos seguido optimizar este método para el aislamiento de los capilares del cerebro humano y, recientemente, nos mostraron mayor expresión de P-gp en el humana barrera hemato – encefálica en pacientes con epilepsia en comparación con los individuos del control de asimiento-libre³⁸ . Tomados juntos, estos desarrollos demuestran que los capilares del cerebro aislado pueden servir como modelo para estudiar la función de barrera.

Varios en vivo, ex vivoy en vitro barrera blood – brain los modelos se han utilizado en investigación básica y la detección de drogas industriales, principalmente con el objetivo de la prueba de entrega de la droga al cerebro^{39,40,41 ,42,43,44}. Además aisladas ex vivo capilares del cerebro, modelos actuales de la barrera hemato – encefálica incluyen en silico modelos, en vitro cultura de célula de las células endoteliales capilares cerebrales aislados o líneas de células inmortalizadas de varios especie, en vitro cultura de células de madre pluripotenciales humanas (hPSC) que se diferencian en células endoteliales capilares del cerebro y modelos de microfluidos en un chip.

Modelos in silico se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos de selección de candidatos de la droga basados en predicha de la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) propiedades. Métodos tales como modelos de relación (QSPR) propiedad de la estructura cuantitativa y cuantitativa estructura-actividad relación (QSAR) son métodos populares utilizados en el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas predecir penetración cerebral de fármacos candidatos ^{45 , 46}. estos modelos son útiles para las moléculas de la pantalla de propiedades de penetración de barrera.

Betz et al. ⁴⁷ estableció monocapas de células endoteliales capilares cerebrales cultivadas como un sistema de modelo en vitro barrera blood – brain. In vitro de la célula cultura modelos tejido fresco o líneas celulares endoteliales inmortalizado como las células endoteliales del microvessel cerebral humano (hCMECs) pueden ser otra herramienta de proyección de alto rendimiento para la penetración del cerebro o estudios mecanísticos. Sin embargo, modelos de cultura de célula endotelial capilar cerebral falta el estrés fisiológico del esquileo del flujo de sangre dentro del lumen capilar están limitados en su complejidad biológica en general y experimentan cambios en la expresión y localización de los componentes importantes de la barrera como las proteínas de Unión estrecha, iones, transportadores, enzimas y receptores de la superficie de canales^48,49,50. Por el contrario, monocapas endoteliales derivan de hPSCs, tienen sacarosa baja permeabilidad en comparación con las culturas hCMEC/D3 y contener expresión polarizada de algunos transportadores de la barrera blood – brain, moléculas de adhesión y uniones estrechas^{51, 52}. sin embargo, estas células también están sujetos a cambio de las propiedades en la cultura y el sistema debe ser validado para su recapitulación en vivo barrera propiedades⁵².

Nuevas tendencias en la investigación de la barrera hemato – encefálica incluyen utilizando sistemas de cultivo de tejidos 3D para crear capilares artificiales, utilizando la tecnología del órgano-on-chip para generar dispositivos microfluídicos, o utilizando la tecnología de fibra hueca^{53, 54 , 55}. los capilares artificiales, sin embargo, tienen significativamente mayores diámetros (100 – 200 μm) que los capilares cerebrales (3 – 7 μm). Por lo tanto, el esquileo las fuerzas en vitro no completamente se asemejan a la situación en vivo . Esto se aborda en los dispositivos microfluídicos “blood-brain-barrier-on-a-chip”, donde compartimientos de “sangre” y “cerebro” de forma artificial de las membranas y líquidos son bombeados a través de estos dispositivos microfluídicos fuerzas de esquileo. Del mismo modo, co-cultivos de células endoteliales en varias combinaciones con astrocitos y células musculares lisas vasculares también han sido utilizados con la tecnología de fibra hueca para recrear parámetros reológicos presentes en vivo las condiciones^{56 , 57 , 58}. sin embargo, no está claro cómo este modelo refleja otras propiedades de la barrera hemato – encefálica como transporte, metabolismo, señalización y otros. Estos modelos artificiales capilar y chip son adecuados para la detección de alto rendimiento de drogas, pero las células utilizadas para generar estos modelos también están sujetos a cambio en la cultura.

Rebanadas de cerebro congelado y fijo o cerebro primario, cultivos de células endoteliales capilares son modelos adicionales que pueden utilizarse paraestudiar la microcirculación humana^5,59,60,61. Por ejemplo, inmunohistoquímica del tejido de cerebro fija se utiliza para determinar la localización de proteínas y expresión en sana en comparación con el tejido enfermo.

Además de los modelos en vitro y rebanadas de tejido capilares descrita, recientemente aisladas del cerebro pueden ser utilizados para estudiar la función de la barrera blood – brain. Limitaciones de este modelo capilar aislada incluyen la dificultad para obtener tejido cerebral humano fresco, ausencia de astrocitos y neuronas y un proceso relativamente largo de aislamiento. Una ventaja del modelo capilar cerebral aislado es que este modelo se parece a la situación en vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para caracterizar la disfunción y la función de barrera. Lo importante, también puede ser utilizado para discernir mecanismos de señalización mediante multitud de ensayos y técnicas moleculares^3,19,62,63.

Nuestro laboratorio tiene acceso a ambos tejidos frescos y congelados de cerebro humano a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. En este contexto, las autopsias siguen un protocolo estándar, se obtienen cerebros en < 4 h y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas⁶⁵. Dado este acceso único para el tejido cerebral humano, establecimos y optimizado un protocolo para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano que se traduce en un alto rendimiento de tubos capilares del cerebro humano intacto y viable. Dos extremos comunes de interés son para determinar la expresión de la proteína y la actividad. En este sentido, nosotros y otros hemos establecido varios ensayos que pueden utilizarse para estudiar la expresión de la proteína y niveles de actividad con los capilares del cerebro aislado. Estos ensayos incluyen el Western Blot, Western Simple ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), zymography, ensayos de actividad de transporte, y ensayos de fuga capilar. Estos ensayos permiten a los investigadores a estudiar los cambios en la función de barrera en condiciones patológicas humanas, determinar las vías que regulan la actividad y expresión de la proteína e identificar dianas farmacológicas para el tratamiento de la barrera hemato – encefálica asociada enfermedades.

Tomados juntos, recién los capilares del cerebro aislado pueden servir como un modelo robusto y reproducible de la barrera blood – brain. Sobre todo, este modelo puede combinarse con muchos diferentes ensayos para determinar una amplia gama de puntos finales para el estudio de la función barrera.