Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Die Blut – Hirn-Schranke ist eine streng kontrollierte Schnittstelle zwischen Blut und Gehirn, der bestimmt, was geht in und aus dem Gehirn heraus kommt. Anatomisch, Endothelzellen der Blut – Hirn-Schranke zu komponieren und bildet eine komplexe, durchgehende kapillarnetzes. Physiologisch, versorgt dieses engmaschiges Netz das Gehirn mit Sauerstoff und Nährstoffen während gleichzeitig Entsorgung von Kohlendioxid und Abfallprodukte des Stoffwechsels. Wichtig ist, unterstützt Beweise, dass die Änderungen an der Schranke zu zahlreichen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Epilepsie und Schlaganfall^1,2,3,4,5 beitragen ^{, 6 , 7}. Gehirn endotheliale Zellen auch als ein Hindernis für die Behandlung dienen durch die Blockierung der Droge Aufnahme ins Gehirn, zB., Chemotherapie von Glioblastoma Multiforme nach Tumor Resektion^{8,9, 10}. In diesem Zusammenhang isolierte Gehirn-Kapillaren stellen eine einzigartige ex Vivo Blut – Hirn-Schranke Modell, das Barriere Eigenschaften in-vivo, ähnelt die für das Studium der Barriere-Funktion und Dysfunktion im Gesundheitswesen ermöglicht und Krankheit. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren vom menschlichen Gehirn auf eine gleichbleibend hohe Qualität der Kapillare zu isolieren und Ertrag um die Blut – Hirn-Schranke zu studieren.

Im Jahr 1969 Siakotos Et Al. ¹¹ waren die ersten, die Isolation der Gehirn-Kapillaren aus Rind- und menschlichen Hirngewebe mit Steigung Zentrifugierung und Glas Bead Spalte dichtetrennung zu melden. Später, Goldstein Et al. ¹² verbessert diese Methode, indem mehrere filtrationsschritte verringern die Menge des Gewebes erforderlich, Gehirn-Kapillaren von Ratten, unter Beibehaltung der Stoffwechselaktivität der Glukose Transport isoliert zu studieren. Seitdem optimiert Forscher die Kapillare Isolierung Verfahren mehrfach, Verbesserung der Methode und des Gehirns Kapillaren Modells mit jeder Iteration^13,14,15. Z. B. Pardridge Et Al. ¹⁶ bovine Kapillaren mit enzymatischen Verdauung anstelle mechanischer Homogenisierung isoliert, und dann anschließend eine Kapillare Suspension durch ein Filtersieb 210 µm und eine Glassäule Wulst. Diese Änderungen verbessert den Trypan blau Ausgrenzung Fleck isolierte Gehirn-Kapillaren und so erhöhte endotheliale Zellviabilität. Anfang der 1990er Jahre Dallaire Et Al. ¹⁷ isoliert Rindern und Ratte Kapillaren, die waren frei von neuronalen Kontamination und metabolische Aktivität der γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTase) und alkalische Phosphatase gepflegt. Im Jahr 2000 Miller Et Al. ¹⁸, verwendet isolierten Ratten und Schweinen Gehirn Kapillaren in Kombination mit konfokalen Mikroskopie um zu zeigen, die Anhäufung von Transport-Substrate in das Lumen der Kapillaren. Anschließend haben unser Labor hat weiterhin das Gehirn Kapillare Isolierung Verfahren zu optimieren und wir Transport Tests ermitteln, P-Glykoprotein (P-Gp)^19,20,21, Brustkrebs Widerstand Protein (BCRP)^22,23und Multi-Drug Resistance Protein 2 (Mrp2)²⁴ Transportaktivität. Im Jahr 2004 veröffentlichten wir zwei Berichte wo wir isolierte Ratte Gehirn Kapillaren verwendet, um verschiedene Signalwege zu untersuchen. In Hartz Et Al. ²¹, fanden wir, dass das Peptid Endothelin-1 schnell und reversibel P-Gp Transportfunktion im Gehirn Kapillaren durch Einwirkung durch Endothelin-Rezeptor B (ET_B) Rezeptor, Stickoxid-Synthase (NOS) und Proteinkinase C (PKC) reduziert. In Bauer Et al. ¹⁹, haben wir bewiesen, Ausdruck des nuklearen Rezeptoren Pregnane X-Rezeptors (PXR) und zeigte PXR-Modulation des P-Gp Ausdruck und Transport-Funktion im Gehirn-Kapillaren. In Experimenten mit transgenen Mäusen, humanisierter PXR wir diese Linie der Forschung erweitert und zeigte in Vivo Verschärfung der Barriere von heraufregulierende P-Gp durch hPXR Aktivierung²⁵. Im Jahr 2010 Hartz Et Al. ²⁶ verwendet diesen Ansatz zur Wiederherstellung von P-Gp-Protein-Expression und Aktivität in transgenen menschlichen Amyloid-Precursor-Protein (hAPP)-Mäuse, die hAPP overexpress zu transportieren. Darüber hinaus reduziert Wiederherstellung des P-Gp in hAPP Mäuse Beta-Amyloid (Aβ)₄₀und Aβ-₄₂-Gehirn-Spiegel.

Neben dem Studium Signalwege, lässt die isolierte Gehirn-Kapillaren Veränderungen in Kapillare Permeabilität bestimmen, welche wir als Kapillare durchsickern bezeichnen. Insbesondere dient der Texas Red-Leckage-Test zur Bewertung Austreten von der Fluoreszenzfarbstoff Texas Red aus der Kapillare Lumen über Zeit und diese Daten werden verwendet, um die Leckraten zu analysieren. Verstärkte Kapillare Leckraten im Vergleich zu denen von Kontrolle Kapillaren anzugeben Änderungen in die körperliche Integrität der Blut – Hirn-Schranke². Dies ist wertvoll, denn es zahlreiche Krankheitszustände Barriere Störung, z.B.zugeordnet gibt., Epilepsie, Multiple Sklerose, Alzheimer-Krankheit und Schädel-Hirn Verletzungen^{27,28,29, 30}. Andere Gruppen haben auch isolierte Kapillaren um Signalwege zu erkennen, die Protein-Expression und Transportaktivität Proteine^{31,32,33,34regulieren genutzt, 35,36,37}. Schließlich haben wir diese Methode für die Isolierung der Kapillaren des menschlichen Gehirns zu optimieren und, vor kurzem, wir zeigten erhöhte P-Gp Ausdruck im menschlichen Blut – Hirn-Schranke bei Patienten mit Epilepsie im Vergleich zu anfallsfrei Kontrolle³⁸ . Zusammengenommen zeigen diese Entwicklungen, dass isolierte Gehirn-Kapillaren als ein vielseitiges Modell Barrierefunktion studieren dienen können.

Verschiedenen in vivo, ex-Vivound in Vitro Blut – Hirn-Schranke-Modelle wurden in Grundlagenforschung und der industriellen Drogentest, vor allem mit dem Ziel der Drug-Delivery zum Gehirn^{39,40,41 Tests verwendet ,42,43,44}. Neben isolierten ex Vivo Gehirn-Kapillaren sind aktuelle Modelle der Blut – Hirn-Schranke in Silico Modelle, in Vitro Zellkultur von isolierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen oder immortalisierte Zelllinien aus verschiedenen Arten, in-vitro- Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC), die in Kapillare endothelial Zellen des Gehirns und mikrofluidischen Modelle auf einem Chip zu differenzieren.

In Silico Modelle sind am häufigsten in der Medikamentenentwicklung verwendet, für die Auswahl von Arzneimittelkandidaten anhand der prognostizierten Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) Eigenschaften. Methoden wie quantitative Struktur-Eigenschaft Beziehung (QSPR) Modelle und quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR) Modelle sind beliebte Methoden im Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken, Gehirn Eindringen von Wirkstoffkandidaten vorauszusagen ^{45 , 46}. diese Modelle eignen sich zur Bildschirm-Moleküle für Barriereeigenschaften eindringen.

Betz Et al. ⁴⁷ Monolagen der kultivierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen als ein in-vitro- Blut – Hirn-Schranke Modellsystem etabliert. In-vitro- Kultur zellmodelle mit frischem Gewebe oder verewigt endotheliale Zell-Linien wie menschlichen zerebralen kapilläre Endothelzellen (hCMECs) können ein weiteres Hochdurchsatz-Screening-Tool für Gehirn eindringen oder mechanistische Studien sein. Jedoch Gehirn Kapillare endothelial Zelle Kultur Modelle fehlen die physiologischen Scherspannung des Blutflusses in der Kapillare Lumen, sind in ihrer gesamten biologischen Komplexität begrenzt und Veränderungen in Ausdruck und Lokalisierung der Hindernis-Komponenten wie tight Junction Proteinen Kanäle Oberfläche Rezeptoren, Transporter, Enzyme und Ionen-^48,49,50. Umgekehrt, endotheliale Monolagen abgeleitet hPSCs, niedrigen Saccharose Durchlässigkeit im Vergleich zu hCMEC/D3 Kulturen und enthalten polarisierte Ausdruck einige Blut – Hirn-Schranke Transporter, Adhäsionsmoleküle und tight Junctions^{51, 52}. allerdings diese Zellen unterliegen ebenfalls ändern Eigenschaften in der Kultur, und das System muss für die Reprise des in Vivo Barriere Eigenschaften⁵²validiert werden.

Neuere Trends in der Blut – Hirn-Schranke Forschung umfassen unter Verwendung 3D Zellkultur Systeme schaffen künstliche Kapillaren, mit der Orgel-on-Chip-Technologie um mikrofluidischen Geräte verursachen, oder unter Verwendung der Hohlfaser-Technologie^{53, 54 , 55}. künstliche Kapillaren haben jedoch deutlich größere Durchmesser (100 – 200 µm) als Gehirn-Kapillaren (3 – 7 µm). Daher ähneln die Schere Kräfte in Vitro nicht vollständig die in-Vivo -Situation. Dies richtet sich in “blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrofluidischen Geräten, wo künstliche Membranen Form “Blut” und “Gehirn” Fächern und Flüssigkeiten durch diese Geräte erzeugen mikrofluidischen Scherkräfte gepumpt werden. In ähnlicher Weise wurden ko-Kulturen von Endothelzellen in verschiedenen Kombinationen mit Astrozyten und vaskulären glatten Muskelzellen auch mit der Hohlfaser-Technologie zur rheologischen Parameter unter in Vivo Bedingungen⁵⁶ neu ^{, 57 , 58}. es ist jedoch unklar, wie gut dieses Modell andere Eigenschaften die Blut – Hirn-Schranke, wie Transport, Stoffwechsel, Signalisierung und andere reflektiert. Diese künstliche Kapillare und Chip-Modelle eignen sich für Hochdurchsatz-Screening von Drogen, aber die Zellen zur Erzeugung von diesen Modells vorbehalten auch während der Kultur.

Gefrorene und festen Gehirnscheiben oder primäre Gehirn, die Kapillare endothelial Zellkulturen sind weitere Modelle, dieStudie der menschlichen Microvasculature^5,59,60,61genutzt werden können. Zum Beispiel Immunohistochemistry von festen Hirngewebe dient zur Bestimmung von Protein-Lokalisierung und Ausdruck in gesunden im Vergleich zu erkranktem Gewebe.

Neben Gewebe Scheiben und die in-vitro- Modelle können oben beschrieben, frisch isolierte Gehirn-Kapillaren genutzt werden, um die Funktion der Blut – Hirn-Schranke zu untersuchen. Einschränkungen dieses isolierte Kapillare Modells umfassen die Schwierigkeit zu frischem menschlichen Hirngewebe, Abwesenheit von Astrozyten und Neuronen und eine relativ aufwändige Isolierung Prozess. Ein Vorteil der Kapillare isolierte Gehirn-Modells ist, dass dieses Modell die in-Vivo -Situation ähnelt und daher verwendet werden, kann um die Barriere-Funktion und Dysfunktion zu charakterisieren. Wichtig ist, kann auch verwendet werden, zu erkennen, Signalisierung Mechanismen, die mit einer Vielzahl von Tests und Verfahren der molekularen^3,19,62,63.

Unser Labor hat Zugang zu beiden frischen und gefrorenen menschlichen Hirngewebe durch die Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. In diesem Zusammenhang Autopsien folgen ein Standardprotokoll, Gehirne erhalten in < 4 h und alle Verfahren entsprechen den Best Practices von NIH Ibbl⁶⁵. Angesichts dieser einzigartigen Zugang zum menschlichen Hirngewebe, wir eingerichtet und optimiert ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu isolieren, der eine hohe Ausbeute an intakten, lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren führt. Zwei gemeinsame Endpunkte von Interesse sind die Protein-Expression und Aktivität zu bestimmen. In diesem Zusammenhang haben wir u.a. verschiedene Assays etabliert, die mit isolierte Gehirn-Kapillaren verwendet werden können, um Protein-Expression und Aktivität zu studieren. Diese Tests umfassen, Western blotting, einfache Western-Assay, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Zymography, Transport-Aktivität-Assays, und Kapillare durchsickern Assays. Diese Tests erlauben Forschern Änderungen in Barriere-Funktion im menschlichen pathologischen Bedingungen zu studieren, bestimmen Signalwege, die Protein-Expression und Aktivität zu regieren und ermitteln pharmakologische Ziele für die Behandlung von Blut – Hirn-Schranke verbunden Krankheiten.

Frisch zusammen genommen können isolierte Gehirn-Kapillaren als stabile und reproduzierbare Modell der Blut – Hirn-Schranke dienen. Dieses Modell ist vor allem, mit vielen verschiedenen Assays zu bestimmen, eine breite Palette von Endgeräten, Barrierefunktion zu studieren kombinierbar.