Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

A capacidade de regenerar um órgão, ou para restaurar a forma e função, foi pensada para ser principalmente perdido ao longo do tempo evolutivo. O potencial regenerativo do fígado dos mamíferos adulto após lesão aguda de química ou física foi encontrado para envolver a mobilização de todos os hepatócitos restantes, resultando em ondas de hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular, resultando em um funcional, mas arquitetonicamente diferente órgão^1,2,3,4,5. Recentemente, estudos começaram a caracterizar a resposta regenerativa dos órgãos de mamíferos neonatais a lesão na primeira semana de vida^6,7,8. Estes estudos têm mostrado que, quando feridos durante o desenvolvimento neonatal, certos órgãos de mamíferos respondem com regeneração morfológica em vez de compensação crescimento ou fibrose^7,8.

Estudos recentes demonstraram que a regeneração da estrutura global e a função ocorre durante o início período neonatal^6,7,8. Lesão hepática estabelecidos protocolos envolvem lesão química ou administração de etanol^9,10,11, paracetamol^12,13,14,15 , tetracloreto de carbono^16,17,18,19, 70% hepatectomy parcial^4,20,21ou remoção da esquerda e lóbulos medianos. Administração química leva à morte de células do hepatócito, mas muitas vezes deixa o micro e macroestruturas intactas. Regeneração morfológica não pode prontamente ser estudada neste contexto, como a arquitetura hepática em geral não se extinguiu. A hepatectomy parcial 70% envolve a ligadura da sutura dos vasos grandes, que é necessária para parar o sangramento, mas deixa um ambiente não-fisiológica com interrupção permanente da vasculatura. Além disso, esse método só tem sido utilizado em roedores adultos, e sua aplicação para neonatos tecnicamente é extremamente difícil. Com isto em mente, desenvolvemos um método em que 20-30% do ápice do lobo esquerdo é removido em um recém-nascido mouse P0 (figura 1A-1B). Este método é cirurgicamente conservador, minimamente invasivo, não tecnicamente desafiador e leva à perda da morfologia sem a ligadura da vasculatura, deixando espaço para a regeneração ocorra de efectivação. O protocolo resultante do passo a passo, descrito abaixo, permite a qualquer pesquisador realizar uma hepatectomy parcial lobular em ratos neonatais para estudar mamíferos regeneração neonatal nas fases iniciais de vida pós-natal. Esse método também tem aplicações claras para estudos comparativos em medicina regenerativa e biologia de células-tronco, como ele pode ser usado no fígado durante as fases posteriores da vida.

Os estudos mais comuns de lesão hepática aguda são quimicamente induzida dano, amputação de fígado adulta ou hepatectomy parcial de 70%. Dano químico muitas vezes envolve a administração intravenosa, intraperitoneal ou oral de paracetamol, tetracloreto de carbono ou etanol e é um modelo de lesão relativamente fácil e não-invasiva. Como já discutido, resultados de dano químico na morte de celular do hepatócito, mas muitas vezes folhas estroma e parênquima estruturas intactas, tornando-se difícil fazer afirmações sobre regeneração morfológica. Dano químico muitas vezes gira em torno dos vasos hepáticos, tornando-se uma técnica útil para estudar o local e a lesão de células específicas, mas também dificulta a interrogar, no nível do órgão inteiro, outras populações que pode situar-se longe dos navios e que podem contribui para a regeneração. Apesar dessas limitações, dano químico continua a ser um modelo de lesão altamente fisiologicamente relevantes e úteis.

Adulto hepatectomy parcial de 70% envolve a remoção dos lobos esquerdos e medianos após ligadura da vascularização hepática. A resposta a hepatectomy tem sido bem caracterizada: o fígado amputado 14 dias pós 70% hepatectomy parcial desenvolve uma arquitetura grosseiramente diferente do lobo original intacto, como os hepatócitos dos lobos direito e caudados restantes submeter-se hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular^4,5. Isto torna-se massa perdida e função, mas falha regenerar os dois lobos amputados e, portanto, não substitui a morfologia bruta. Como resultado, a resposta da lesão a hepatectomy parcial 70% é útil para estudar os mecanismos de crescimento compensatório com regeneração limitada.

Aqui, descrevemos totalmente um protocolo para um hepatectomy lobular parcial neonatal. O procedimento envolve a seleção apropriada de animais e preparação, preparação do campo cirúrgico, cirurgia e recuperação. Otimização e adaptação de cada uma dessas etapas podem ser necessárias para diferentes aplicações do protocolo.

Temos amplamente realizada e otimizado este protocolo sobre filhotes de C57BL/6J de tipo selvagem (JAX 000664), no entanto, para estudar populações de células diferentes e mecanismos de regeneração, também usamos vários animais transgénicos, incluindo ratos, abrigando diversos Cre e CreERT2 transgenes e/ou bater-ins (JAXAxin2^CreERT2 018867, e Sox9^CreERT2 JAX 018829) em combinação com repórteres fluorescentes, tais como sistemas de arco-íris e mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. não encontramos nenhuma necessidade de mudar esta metodologia para as estirpes de mouse diferente, como não nos resultados de sobrevivência ou potencial regenerativo foram observadas diferenças.

Além de usar diferentes estirpes animais, realizamos também parcial hepatectomies lobular em neonatais ratos tratados com pequenas moléculas, tais como 4-hidroxi-tamoxifeno e 5-ethynyl-2-desoxiuridina (EdU). Dimetilsulfóxido (DMSO) e etanol foram usados como solventes, como verificou que o óleo de milho era uma importante causa de morbidade. Caso contrário encontramos que a administração intraperitoneal de pequenas moléculas não afetou sobrevivência ou resultados regenerativos. Podemos prever que o presente protocolo será adaptado para uso com outras moléculas pequenas para interrogar os vários aspectos da regeneração.

Cirurgias de rato neonatal podem ser tecnicamente desafiadoras e podem exigir conhecimentos especiais na manipulação de animais e de dissecação microscópica. Experiência de criação de animais é necessária para evitar o canibalismo materno após a cirurgia e durante o período de recuperação imediata.