Epatectomia parziale lobulare: Un modello chirurgico per rigenerazione epatica morfologica

La capacità di rigenerare un organo, o per ripristinare la forma e funzione, è stata pensata per essere per lo più perso nel tempo evolutivo. La capacità rigenerativa del fegato dei mammiferi adulto dopo lesione acuta chimico o fisico è stato trovato per coinvolgere la mobilitazione di tutti gli epatociti rimanenti conseguente onde dell’ipertrofia e alcuni cicli di divisione cellulare, risultante in un funzionale ma architettonicamente differenti dell’organo^1,2,3,4,5. Recentemente, gli studi hanno cominciato a caratterizzare la risposta rigenerativa degli organi dei mammiferi neonatale alla ferita entro la prima settimana di vita^6,7,8. Questi studi hanno dimostrato che quando ferito durante lo sviluppo neonatale, determinati organi mammiferi rispondano con rigenerazione morfologica invece compensativo crescita o fibrosi di^7,8.

Recenti studi hanno dimostrato che la rigenerazione della struttura globale e la funzione si verifica durante l’iniziale periodo neonatale^6,7,8. Protocolli stabiliti al fegato coinvolgere ferita chimica o la somministrazione di etanolo^9,10,11, acetaminofene^12,13,14,15 , tetracloruro di carbonio^16,17,18,19, 70% hepatectomy parziale^4,20,21o la rimozione di sinistra e lobi mediani. Chimica amministrazione conduce alla morte delle cellule dell’epatocita, ma spesso lascia micro – e macro-strutture intatte. Rigenerazione morfologica non può essere facilmente studiati in questo contesto, come l’architettura epatica nel complesso non è stato cancellato. L’epatectomia parziale 70% comporta la legatura sutura dei vasi principali, che è necessaria per fermare l’emorragia, ma lascia un ambiente non-fisiologica con rottura permanente del sistema vascolare. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato solo sui roditori adulti, e la sua applicazione ai neonati tecnicamente è estremamente difficile. Con questo in mente, abbiamo sviluppato un metodo in cui 20-30% dell’apice del lobo di sinistra è stata rimossa in un neonato mouse P0 (Figura 1A-1B). Questo metodo è chirurgicamente conservatore, minimamente invasiva, non tecnicamente impegnativi e conduce al lordo di perdita della morfologia senza legatura della vascolarizzazione, lasciando spazio per la rigenerazione si verifichi. Il risultante protocollo passo dopo passo, descritto di seguito, consente qualsiasi ricercatore eseguire un hepatectomy parziale lobular su topi neonatali per lo studio dei mammiferi rigenerazione neonatale nelle prime fasi di vita post-natale. Questo metodo ha anche applicazioni chiare agli studi comparativi in medicina rigenerativa e biologia delle cellule staminali, come può essere utilizzato nel fegato durante le fasi successive della vita.

Gli studi di lesioni epatiche acute più comuni sono danni indotti chimicamente, l’amputazione del fegato adulto o hepatectomy parziale 70%. Danni chimici spesso prevede la somministrazione per via endovenosa, orale o intraperitoneale di paracetamolo, tetracloruro di carbonio o etanolo ed sono un modello relativamente semplice e non invasiva di lesioni. Come precedentemente discusso, danni chimici risultati nella morte cellulare dell’epatocita, ma spesso foglie dello stroma e parenchima strutture intatte, rendendo difficile fare affermazioni circa morfologiche rigenerazione. Danni chimici spesso è incentrata su vasi epatici, che lo rende una tecnica utile per studiare il sito e ferita cellula-specifico, ma rende anche difficile interrogare, a livello di intero organo, altre popolazioni che possono essere situati più lontano di vasi e che possono contribuire alla rigenerazione. Nonostante queste limitazioni, danni chimici rimangono ancora un modello utile e altamente fisiologicamente rilevante pregiudizio.

Adulti 70% hepatectomy parziale comporta la rimozione dei lobi sinistro e mediani dopo la legatura del sistema vascolare epatica. La risposta all’epatectomia è stata caratterizzata bene: il fegato amputato 14 giorni post 70% hepatectomy parziale si sviluppa un’architettura grossolanamente diversa da quello del lobo originale intatto, come gli epatociti di lobi di destra e Caudati rimanenti sottoposti a ipertrofia e un paio di giri di divisione cellulare^4,5. Questo rende perso massa e funzione, ma non riesce a rigenerare i due lobi amputati e pertanto non sostituisce lordo morfologia. Di conseguenza, la risposta di lesione all’epatectomia parziale 70% è utile per lo studio dei meccanismi di crescita compensatoria con rigenerazione limitata.

Qui, descriviamo completamente un protocollo per un neonatale hepatectomy parziale lobulare. La procedura prevede la selezione di animali appropriati e preparazione, preparazione del campo chirurgico, chirurgia e recupero. Ottimizzazione e adattamento di ognuno di questi passaggi possono essere necessari per le diverse applicazioni del protocollo.

Abbiamo ampiamente eseguita e ottimizzato questo protocollo su cuccioli di tipo selvatico C57BL/6J (JAX 000664), tuttavia, per studiare i meccanismi di rigenerazione e di diverse popolazioni cellulari, abbiamo anche usato vari animali transgenici, compreso i topi che harboring Cre vari e CreERT2 transgeni e/o knock-in (JAXAxin2^CreERT2 018867, e JAX Sox9^CreERT2 018829) in combinazione con reporter fluorescenti, come i sistemi di Rainbow e mTmG (R26^VT2/GK3, R26 ^mT/mG) ^{22 , 23}. abbiamo non trovato nessuna necessità di cambiare questa metodologia per ceppi di topi diversi, come sono state osservate differenze nella sopravvivenza o potenziale rigenerativo.

Oltre all’utilizzo di diversi ceppi di animali, abbiamo anche effettuato parziale hepatectomies lobular su neonatali topi trattati con piccole molecole, quali 4-idrossi-tamoxifen e 5-Etinil-2 ‘-deoxyuridine (EdU). Solfossido dimetilico (DMSO) e l’etanolo sono stati utilizzati come solventi, come è stato trovato che l’olio di mais era una causa significativa della morbosità. Abbiamo trovato altrimenti che la somministrazione intraperitoneale di piccole molecole non ha colpito esiti rigenerative o sopravvivenza. Prevediamo che questo protocollo sarà adattato per l’uso con altre piccole molecole per interrogare i vari aspetti della rigenerazione.

Interventi chirurgici del mouse neonatale possono essere tecnicamente impegnativi e possono richiedere particolari competenze nella gestione degli animali e dissezione microscopica. Agricoltura animale ed è necessaria per evitare cannibalismo materna dopo l’intervento e durante il periodo di recupero immediato.