Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas Aeruginosa ist ein phänotypisch und genotypisiert vielfältig und anpassbar gramnegatives Bakterium in Boden, Wasser, sowie die meisten menschlichen Umgebungen und Mikroflora der Haut vorhanden. Im Vergleich zu vielen Bakterienarten, hat p. Aeruginosa eine relativ große Genom von 5,5-7 Mbp mit hohen G + C-Gehalt (65-67 %). Darüber hinaus ein erheblicher Teil seiner Gene metabolische Anpassungsfähigkeit beteiligt sind und sind Teil des regulatorischen Netzwerken ermöglicht große Flexibilität bei der Reaktion auf Umweltstress¹. P. Aeruginosa drückt eine Fülle von Virulenzfaktoren, Neigung, Form Biofilme Exponate besitzt die Fähigkeit, Antworten durch mehrere Quorum-sensing-Wege zu koordinieren und zeigt eine bemerkenswerte Fähigkeit, Antibiotika-Resistenz zu entwickeln und Toleranz^{2,3,4,5,6,7,8}. Diese Attribute stellen große Herausforderungen für die Behandlung von Infektionen durch p. Aeruginosa.

Chronische p. Aeruginosa Infektion können bei vielen Krankheitszuständen auftreten. Cystische Fibrose (CF), eine genetische Krankheit, die durch Mutation des Gens Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) verursacht wiederum eingedickten, infizierte Sekrete in den Atemwegen, progressive Bronchiektasen und letztlich zum Tod respiratorische Insuffizienz⁹. Erwachsenenalter sind die Mehrzahl der Patienten mit CF chronisch mit p. Aeruginosa, infiziert, eine Schlüsselrolle in der Morbidität und Mortalität dieser Krankheit¹⁰zugeordnet spielt. Darüber hinaus sind Patienten mit schweren Verbrennungen Verletzungen¹¹, Tracheotomien¹², Gelenkersatz¹³oder indwelling Katheter¹⁴ für p. Aeruginosa Infektion im Zusammenhang mit den Bakterien die Fähigkeit Form gefährdet Biofilme und Flucht zu Host Entzündungsreaktionen¹⁵. Kolonisierung weiter, auftritt ohne Konkurrenz, nachdem eine Multi-Antibiotika resistente oder tolerantere Bevölkerung durch Breitspektrum, sequentielle antimikrobielle Behandlung^12,16,17 ausgewählt ist ^{, 18}. besseres Verständnis der Pathogenese von p. Aeruginosa haben erhebliche Auswirkungen auf zahlreiche Krankheitszustände.

Mehrere p. Aeruginosa klinische Isolaten, einschließlich Belastungen PAO1, PA103, PA14 und PAK, haben ausgiebig untersucht, um verschiedene Funktionen von p. Aeruginosa Pathogenese zu untersuchen. Stamm PA14 ist eine klinische Isolate, die gehört zu den häufigsten klonalen Gruppen weltweit^19,20 und nicht ausgiebig im Labor passagiert. PA14is hoch virulenten in vertebrate Modelle der Infektion, mit einer bemerkenswerten Endotoxin Profil²¹, Pili Struktur²², Pathogenität Inseln²³, Typ III-Sekretion System (SSTT), Zytotoxizität gegenüber Säugetieren Zellen²⁴ und Profile in antibiotische Resistenz und Dauerhaftigkeit²⁵. Darüber hinaus PA14 ist auch in zahlreichen Wirt-Pathogen-Modellsystemen hoch virulenten, einschließlich pflanzenblattes Infiltration Modelle^26,27,Caenorhabditis Elegans Infektion Modelle^{28, 29}, Insekt Modelle^30,31, sowie Maus Lungenentzündung Modelle^32,33 und Hautverbrennungen Modelle³⁴.

Genomweite mutierte Bibliotheken sind Sammlungen von isogener Mutanten in nicht benötigten Gene, die sehr leistungsfähige Werkzeuge um die Biologie des Organismus zu verstehen, ermöglicht die Analyse der Genfunktion auf genomischer Ebene darstellen. Zwei in der Nähe von Sättigung Transposon Einfügung mutierten Bibliotheken gebaut in p. Aeruginosa gibt es derzeit für den Vertrieb. Die Einfügung Sehenswürdigkeiten der Transposons sind für beide Bibliotheken ermittelt worden. Diese sogenannten nonredundant Bibliotheken erleichtern genomweite Studien von Bakterienstämmen verringernd, erheblich Zeit und Kosten beteiligt Screening fußgelenkes zufällige Transposon Mutanten. P. Aeruginosa PAO1 Transposon mutierte Bibliothek, gebaut in der MPAO1 von Belastungen PAO1 mit Transposons ISPhoA/ hah zu isolieren und istLacZ/ hah³⁵, wird kuratiert von Manoil Labor, Universität von Washington. Die Bibliothek besteht aus einer Sequenz verifiziert Sammlung von 9.437 Transposon-Mutanten, die große Genom deckt und enthält zwei Mutanten für die meisten Gene³⁶. Informationen über die p. Aeruginosa PAO1 Transposon mutierten Bibliothek steht in der Öffentlichkeit, Internet zugänglichen Manoil Lab-Website unter http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm zur Verfügung. P. Aeruginosa Stamm PA14 nonredundant Transposon Einfügung mutierten Bibliothek (PA14NR eingestellt) Baujahr Belastung PA14 mit Transposons MAR2xT7 und TnPhoA³⁷ derzeit Department of Pediatrics verteilt wird am Massachusetts General Hospital. Das PA14NR-Set umfasst eine Sammlung von mehr als 5.800 Mutanten mit einzelnen Transposon Einfügungen in nicht benötigten Gene³⁷. Details über den Bau des PA14NR-Sets sind in der Öffentlichkeit, Internet zugänglichen Website http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB beschrieben, die enthält auch eine Vielzahl von Online-Such-Tools zur Erleichterung der Nutzung des PA14NR Satz.

Das ursprüngliche PA14NR Set umfasste 5.459 Mutanten, ausgewählt aus einer umfangreichen Bibliothek von ca. 34.000 zufällige Transposon Einfügung Mutanten, die 4.596 vorhergesagten PA14 Gene entspricht 77 % aller vorhergesagten PA14 Gene³⁷entsprechen. Seit dem Bau der Bibliothek im Jahr 2006 neue Mutanten hinzugefügt wurden, und derzeit das PA14NR Set beinhaltet mehr als 5.800 Mutanten-³⁸ , die etwa 4.600 PA14 Gene darstellen. Die Mehrheit der PA14 Transposon Mutanten wurden in der Wildtyp Hintergrund³⁷generiert. Einzelheiten über jedes Mitglied der mutierten Bibliothek, einschließlich genetischen Hintergrund gibt es entweder durch die Online-Datenbank zu suchen, oder durch das Herunterladen der Nonredundant Bibliothek-Tabellenkalkulation, beide Funktionen auf der Website PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Die Mehrheit der Mutanten entstanden mit Hilfe der MAR2xT7 (MrT7) Transposon, mit einer kleinen Gruppe mit der TnPhoA (PhoA) Transposon³⁷erstellt. Jede Transposon hat eine Antibiotika-Resistenz-Kassette, die mutierten Auswahl mit Gentamicin (MrT7) oder Kanamycin (PhoA) ermöglicht. Die PA14NR Gruppe von Mutanten in 63 96-Well-Platten gespeichert und enthält zwei zusätzliche 96-Well-Steuerelement, die Platten, die aus Wildtyp PA14 beimpft und nicht inokulierten Brunnen Zwischenspiele in einem vorgegebenen Muster. Die 96-Well-Plattenformat gepaart mit der Online-Recherche-Tools erheblich erleichtert die kundenspezifische Entwicklung von screening-Tests, mit denen Benutzer auf einfache Weise Gene mutierten Phänotypen zugeordnet. Die Online-Such-Tools erleichtern auch die Suche und Auswahl von zusätzlichen relevanten Mutanten für weitere Studien erforderlich.

Die PA14 und PAO1 Transposon mutierten Bibliotheken sind sehr wichtige globale Ressourcen für die wissenschaftliche Gemeinschaft, und sie ergänzen einander in überprüfen die Funktion der unbekannte Gene und Wege von dieser bakteriellen Erreger. Zufälligerweise hat seit dem Bau der PAO1 und PA14 Transposon Mutation Bibliotheken, voll-DNA-Sequenzierung Genomanalyse viele p. Aeruginosa Isolate gezeigt, dass PAO1 und PA14 zu verschiedenen wichtigen Subclades von P. Aeruginosa gehören Phylogenie^7,39,40,41. Da klinische p. Aeruginosa Isolate werden gefunden verteilt die Stammesgeschichte, die Tatsache, dass PAO1 und PA14 zu verschiedenen p. Aeruginosa gehören Untergruppen steigert den Wert der beiden Transposon Mutation Bibliotheken für vergleichende Studien.

Publikationen, beschreibt die Konstruktion und screening von bakteriellen mutierten Bibliotheken, einschließlich p. Aeruginosa Bibliotheken^35,sind^37,42, leicht zugänglich in der Literatur. Sind jedoch nach bestem Wissen und gewissen, keine veröffentlichten Protokolle beschreibt Einzelheiten der Verfahren und Techniken, die für die Replikation, Wartung und Validierung von bakteriellen mutierten Bibliotheken verfügbar.

Die in dieser Publikation beschriebenen Methodik beschreibt eine Reihe von drei Protokollen, die die Nutzung zu erleichtern und Wartung des PA14NR-Sets. Das erste Protokoll beschreibt Replikation der Bibliothek als Empfänger des PA14NR-Sets empfohlen. Das zweite Protokoll enthält Richtlinien für den Streifen, Anbau und Lagerung von einzelnen durch Mutation entstehende Variationen über das PA14NR-Set identifiziert. Das dritte Protokoll beschreibt qualitätskontrolltechniken, einschließlich PCR Verstärkung der Fragmente von Transposon Mutanten und anschließende Sequenzierung, mutierte Identität zu bestätigen. Dieser Satz von Protokollen kann auch für die Replikation und Wartung anderer Bakterien mutierten Bibliotheken oder Sammlungen angepasst werden. Die Replikation von bakteriellen mutierten Bibliotheken oder Sammlungen wird dringend empfohlen, zur Erhaltung der Integrität der “master-Kopie” (Originalversion erhalten). Replikation von mehreren Kopien der PA14NR-Set für die Routinelabor minimiert die Wahrscheinlichkeit der interwell Kontamination von der master-Kopie.