Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón
Summary
Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.
Abstract
El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal mediante la generación de respuestas tolerantes a antígenos dietéticos y bacterias comensales mientras que montar una respuesta inmune efectiva a enteropatógeno microbios. Además, ha quedado claro que la inmunidad local intestinal tiene un profundo impacto en la inmunidad sistémica y distante. Por lo tanto, es importante estudiar cómo se induce una respuesta inmune intestinal y lo que es los resultados inmunológicos de la respuesta. Aquí, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos del intestino inductivo como de Peyer tejido linfoide asociado a intestino y ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y efectoras como la lámina propia y la epitelio intestinal. Esta técnica asegura el aislamiento de un gran número de linfocitos de los tejidos intestinales pequeñas con óptima pureza, viabilidad y mínima contaminación compartimentación dentro de las limitaciones de tiempo aceptable. La capacidad técnica para aislar los linfocitos y otras células inmunes de los tejidos intestinales permite la comprensión de la respuesta inmune a infecciones gastrointestinales, cánceres y enfermedades inflamatorias.
Introduction
El tracto gastrointestinal (GI) tiene muchos pliegues y protuberancias que representa la interfaz más grande separando el cuerpo interno y el ambiente externo. El sistema inmune intestinal juega un papel esencial en el mantenimiento de la función de barrera del tracto gastrointestinal. Está constantemente expuesto a antígenos dietéticos, las bacterias comensales y microbios patógenos. Como tal, debe seguir siendo tolerante a antígenos alimentarios y bacterias comensales conservando la capacidad de generar rápidamente una respuesta inmune efectiva a microbios enteropatógeno1. El sistema inmune intestinal puede dividirse anatómicamente en inductivo, donde los linfocitos se activan por el antígeno que presenta las células con antígenos de la mucosa intestinal, y efectoras, donde ejercen determinados linfocitos activados de las funciones efectoras2. Los sitios inductivos constituyen la estructura linfoide organizada de placas de Peyer (PP) que examina la luz intestinal directamente a través de la acción de las células M especializadas y nodos de linfa mesentéricos drenantes regionales (MLN). Los sitios efectores consisten en la lámina propia (LP), que es el tejido conectivo debajo de la membrana basal y el epitelio intestinal, una capa de célula situado por encima de la membrana del sótano que contiene linfocitos intraepiteliales (IEL). Los linfocitos son los principales actores de la inmunidad adaptativa que median protección contra infecciones y cánceres y pueden también contribuir a la Inmunopatología de las enfermedades inflamatorias. Es importante y muy relevante para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos anatómicos mucosa para mejor entienden sus funciones inducción y efectoras.
Un protocolo relativamente simple y unificado para el aislamiento de los linfocitos de estos compartimentos se necesita que el número de investigadores explorar eventos inmunes que ocurren en el intestino está acelerando. Varios grupos de investigación han publicado protocolos que comparten varios procesos similares para aislar las células inmunes del ratón pequeños compartimentos intestinal3,4,5,6,7 . Sin embargo, hay varias diferencias técnicas entre ellos según el enfoque del protocolo individual. Por ejemplo, con el foco en el aislamiento de las células inmunes del LP, un protocolo analiza el impacto de varias digestiones enzimáticas en la viabilidad celular, expresión de marcadores de superficie celular y la composición de las células inmunes aislados5. Otro protocolo destaca un método rápido y reproducible para el aislamiento de linfocitos sin densidad centrifugación6. Por último, también existen protocolos específicos con el fin de aislar a los fagocitos mononucleares de capas diferentes de tejido del intestino delgado7. Aquí, se presenta un protocolo altamente reproducible que permite aislamiento secuencial de poblaciones linfocitarias del MLN, PP, LP y IEL compartimiento del intestino delgado.
Nos centramos en aislar poblaciones altamente purificadas de los compartimientos del LP y IEL, que son en gran parte libres de contaminantes de otros compartimentos intestinales. Esto ampliamente utilizado protocolo produce un alto rendimiento de linfocitos máximo puros y viables en tiempo aceptable restricciones4,8,9,10,11,12. Este protocolo también asegura el aislamiento de los linfocitos del compartimiento de LP y IEL con mínima contaminación compartimentación, lo que permite una oportunidad buena fe para el estudio de los linfocitos en los distintos compartimentos. Los linfocitos aislados pueden ser sometidos a manipulaciones más como análisis cytometric del flujo o análisis funcional. Este protocolo se ha aplicado con éxito para el aislamiento de linfocitos de ratón intestino delgado y colon durante infecciones por bacterias como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis infecciones y afecciones inflamatorias como la colitis inducida por químicos y patógenos. Este protocolo también puede utilizarse para aislar las células inmunes innatas como las células dendríticas, macrófagos, neutrófilos y monocitos de ratón intestino delgado y colon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos desde el intestinal mucosa inductivo (MLN y PP) y efectores (compartimiento de LP y IEL). El protocolo ha sido desarrollado para equilibrar la entrada (tiempo) y salida (viabilidad y rendimiento) para maximizar la productividad y resultados. El protocolo también asegura la mínima contaminación compartimentación entre LP y IEL compartimientos.
Varios protocolos para el aislamiento de las células inmunes del intestino …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. es apoyado por subvenciones de NIH (R01 AI076457) y fondos aportados por la Universidad de Stony Brook. Z.Q. es apoyado por los NIH grant (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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