Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma
Summary
Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer’s yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.
Abstract
Bağırsak bağışıklık sistemi etkili bağışıklık yanıtlarını enteropathogenic montaj sırasında hoşgörülü yanıt diyet antijenleri ve Komensal bakteriler oluşturarak gastrointestinal sistem bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar mikroplar. Buna ek olarak, yerel bağırsak dokunulmazlık uzak ve sistemik bağışıklık üzerinde derin bir etkisi vardır açık hale gelmiştir. Bu nedenle, çalışma nasıl bir bağırsak bağışıklık yanıtı indüklenen ve immünolojik sonuç yanıtın ne önemlidir. Burada, detaylı bir protokol gut ilişkili lenfoid doku Peyer’s yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri gibi ince bağırsak endüktif sitelerinden ve lamina propria gibi siteler efektör lenfositler yalıtım için açıklanan ve bağırsak epitel. Bu teknik en uygun saflık ve canlılığı ve kabul edilebilir zaman kısıtlamaları içinde en az çapraz compartmental bulaşma ile yalıtım lenfositler küçük bağırsak dokulara gelen çok sayıda sağlar. Lenfositler ve bağırsak dokularında diğer bağışıklık hücreleri izole etmek için teknik yeteneği gastrointestinal enfeksiyonlar, kanser ve inflamatuar hastalıklar bağışıklık yanıtlarını anlayış sağlar.
Introduction
Gastrointestinal (GI) sistem birçok kıvrımlar ve iç vücut ve dış çevre ayıran en büyük arabirimini gösterir çıkıntılar vardır. Bağırsak bağışıklık sistemi GI yolu bariyer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynar. Sürekli diyet antijenleri, Komensal bakteriler ve patojenik mikroplar maruz. Bu nedenle, bu hızla enteropathogenic mikroplar1etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için kapasite koruyarak gıda antijenleri ve Komensal bakteriler için dayanıklı kalması gerekir. Bağırsak bağışıklık sisteminin anatomik olarak sunulması antijenleri bağırsak mukoza üzerinden taşıyan hücreler antijen tarafından saf lenfositler etkinleştirdiğiniz yere, endüktif ve nerede aktive lenfositler belirli sarfetmek efektör siteleri, bölünmüş olabilir efektör fonksiyonları2. Endüktif siteleri doğrudan eylem özel M hücreler ve bölgesel boşaltma Mezenterik lenf düğümleri (milyon) yoluyla intestinal Lümen anketler organize lenfoid yapı Peyer’s yamalar (PP) oluşturmaktadır. Membran ve bağırsak epiteli, intraepitelyal lenfosit (IEL) içeren membran yer alan bir tek hücre katmanı altındaki bağ dokusu olan lamina propria (LP), efektör siteleri oluşur. Lenfositler enfeksiyonlar ve kanser karşı koruma aracılık ve immunopathology inflamatuar hastalıklarda da katkıda büyük oyuncular edinilmiş bağışıklığın vardır. Bu önemlidir ve bu farklı lenfosit çalışmaya son derece alakalı anatomik Mukozal bölmeleri için daha iyi indüksiyon ve efektör fonksiyonları anlıyorum.
Bağırsaklarda oluşan bağışıklık olaylar keşfetmek müfettişler sayısı hızlandırılması gibi nispeten basit ve Birleşik iletişim kuralı üzerinden bu bölmeleri lenfositlerin yalıtım için gereklidir. Birkaç araştırma grubu fare küçük bağırsak bölmeleri3,4,5,6,7 bağışıklık hücreleri izole için birkaç benzer işlemler paylaşır protokolleri yayınladık . Ancak, tek iletişim kuralı odak bağlı olarak aralarında birkaç teknik farklar vardır. Örneğin, LP üzerinden bağışıklık hücreleri izole odaklı, bir protokol hücre canlılığı, hücre yüzey marker ifade ve izole bağışıklık hücreleri5kompozisyon çeşitli Enzimatik sindirim etkisini inceliyor. Başka bir protokol için yalıtım lenfositler yoğunluğu Santrifüjü6olmadan hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi vurgulamaktadır. Son olarak, belirli protokoller Ayrıca bağırsağın7farklı doku katmanlarından Mononükleer fagositler yalıtma amacıyla bulunmaktadır. Burada, ince bağırsak milyon, s, LP ve IEL kartı yuvası üzerinden lenfosit nüfusun sıralı yalıtım sağlayan son derece tekrarlanabilir bir protokol sunulmuştur.
Biz yüksek oranda saflaştırılmış örneğin alınma olasılığını büyük ölçüde kirletici bağırsak diğer bölmeleri üzerinden ücretsiz LP ve IEL bölmeleri izole odaklanır. Bu yaygın kullanılan iletişim kuralı üretir kabul edilebilir saat kısıtlamaları4,8,9,10,11,12içinde sonuna kadar saf ve uygun lenfositlerin yüksek bir verim. Bu iletişim kuralı da iyi niyetli bir fırsat bu ayrı bölmeleri lenfosit çalışma izin en az çapraz compartmental bulaşma ile LP ve IEL yuvası üzerinden lenfositlerin yalıtım sağlar. İzole lenfositler akış sitometrik çözümlemesi veya fonksiyonel analiz gibi daha fazla manipülasyonlar tabi. Bu iletişim kuralı başarıyla lenfositler yalıtım için fare ince bağırsak ve kolon Listeria Monositogenez, Salmonella typhimuriumve Yersinia pseudotuberculosis gibi bakteriyel enfeksiyonlar sırasında uygulanmış enfeksiyonlar ve kimyasal ve patojen bağlı kolit gibi inflamatuar koşulları. Bu iletişim kuralı, dendritik hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit fare ince bağırsak ve kolon gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri izole etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaylı bir protokol endüktif (milyon ve PP) Mukozal lenfosit gelen bağırsak yalıtım için sunulur ve efektör (LP ve IEL yuvası) siteleri. Protokol giriş (zaman) ve çıkış (canlılık ve verim) verimlilik ve sonuçları maksimize etmek için dengelemek için geliştirilmiştir. Protokol Ayrıca LP ve IEL bölmeleri arasında en az çapraz compartmental bulaşma sağlar.
Fare bağırsağı bağışıklık hücreleri yalıtım için birkaç protokol-si olmak be yayınlanan<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. NIH grant (R01 AI076457) ve Stony Brook Üniversitesi tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmektedir. Z.Q. NIH tarafından desteklenmektedir (K12 GM102778) verin.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
