インスリン模倣化合物のテスト用のOvo でモデル

EU によると、ディレクティブ 2010/63/、胚の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚の実験は倫理委員会の許可を必要はありません。 1. ストレージと卵の繁殖 地元のブリーダーから受精鶏卵 (資材表) を取得します。注: 卵は、実験のため使用前に敷設した後は、10 日間、加湿雰囲気の 14 ° C で保存されるかもしれない。 10 の 40-60% の平均湿気の 38 ° C で卵を孵化させなさいまたは 11 日インキュベーター、常に卵になります。 2. 卵の選択 11 日間の培養後の受精卵を確認します。このステップでは、candling ライトを使用します。Candling ランプのフリンジを浸し、印肉と卵のとがった側をキャンドルします。 空気の膀胱を識別するために卵の上に明るさの違いを確認します。注: とき卵がー、卵白に暗いですが、空気の膀胱が円形より透明性の領域として表示されます。 空気の膀胱の検出後に場所をマークするために、以前に適用したインクで卵に対して若干ランプを押すと。 卵白と空気の膀胱の明るさの違いが表示されないこの段階で非受精の卵を除外します。 3. 物質の注入 ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) バッファーに必要な濃度の物質を希釈することによって (例えばハーブエキスやインスリン) 関心のある物質を準備します。たとえば、3.3 U/mL の市販インスリン アナログ HBSS の。 選択した化合物のアプリケーションは、慎重に空気の膀胱のマークされた領域にピンセットの先の尖ったペアで卵殻をつつきます。注射器の針の直径より大きい穴を形成しません。注射器を介してついばんだの領域に関心のある物質を含む緩衝液 (300 μ L) を挿入します。注: は、生殖不能、1 ml の使い捨て注射器、ピペット チップおよび容器を使用します。実験のための実験用の上着を着用します。 物質の血ブドウ糖を減らす効果を判断するには、それぞれ 60、120、180 分の定温器に戻って卵を置きます。基底の血ブドウ糖のレベルを決定するため、少なくとも 10-15 非治療卵が含まれます。 4. 毒性試験 24 時間選択した化合物のアプリケーション後、少なくとも 30 のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファー (全体卵殻膜をカバーするために十分な) と卵殻膜を平衡 s。 離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。 先の尖ったピンセットのペアで慎重に卵殻膜をやってのけます。 病変の血管を確認し、ニワトリ胚の活力 (例えば運動) を確認します。注: は、有毒なハーブ抽出の適用後重要な非重要な胚との比較のため図 1を参照してください。 5、血糖値の測定 それぞれの時点で慎重に空気膀胱上卵殻を削除し、(全体卵殻膜をカバーするために十分な) PBS バッファーと卵殻膜を平衡します。 離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。 慎重に先の尖ったピンセットのペアで卵殻膜をやってのけます。 カットし、漿膜マイクロ シザー、適切な血管へのアクセスを有効にするを削除します。膜を切り取り、少なくとも 2 ~ 3 cm。膜胚の不要な血液損失を避けるために自分自身のすべての大型船をカットしないでください。 胚の腹部から大きな容器を探します。閉じたマイクロ ハサミで卵白からこの船を持ち上げ、プラスチック製の pH ストリップの上に置きます。マイクロはさみで開催されている容器の下で pH ストリップを移動し、引いてマイクロはさみ離れて慎重に。 次の手順で血液の希釈を避けるためにピペットで漿膜の下に液体の 1-2 の mL を削除します。容器をカットする前に、容器、フィルター紙の pH ストリップを乾燥します。 1 つの側面のマイクロはさみで慎重に血管をカットします。切らない血管を通じて完全に。注: 船は約 1 mm 厚です。それはオフ ・ ストリップが空転し、採血が可能ではない、完全に船を通って切断を避けるために容器の半分以上をカットしないでください。 ピペットを使用して pH ストリップに漏れの血を収集します。10 マイクロリットル血液の血糖測定器を使用してグルコース レベルを決定する必要があります。 6. 統計学的評価 時点あたり少なくとも 10 個々 の卵の平均値を計算し、コントロール卵 (非またはバッファー処理卵) のいずれかにこれらの値を正規化します。 その後、減少の割合を決定します。さらに、肯定的な制御としてインスリンを使用します。注: は、少なくとも 3 回各実験を繰り返します。