Встраивание парафин и тонкий секционирование колонии микробной биоплёнки для микроскопического анализа

Большинство микробы способны формы биопленки, общины клеток скрепленных собственного производства матриц. Биопленки можно выращивать во многих типах физических установок, с различных режимов предоставления питательных веществ и субстрата. Конкретных анализов для биопленки, как правило, дают воспроизводимости многоклеточные структуры, и общей архитектуры наблюдаются филогенетически разнообразных видов на макроскопическом уровне или сообщества. Когда микробы выращиваются как колоний на твердом носителе под атмосферу, макроскопической морфология передает сведения о емкости для производства матрицы и часто коррелирует с^2,другие черты в ^1,3. Внутренняя архитектура микробной колоний может также предоставить подсказки относительно конкретных биопленки химия и физиология, но было трудно охарактеризовать. Последние приложений загрузки криостата и cryosectioning методов бактериальных колоний позволили изображений и визуализации определенных функций на беспрецедентной резолюции ^4,5,6. Однако исследования с тканей животных показали, что парафин встраивание обеспечивает улучшенный сохранение морфологии, когда по сравнению с загрузки криостата ⁷ и был использован для визуализации бактерий в тканях ^8,9. Поэтому мы разработали протокол для фиксации, внедрение парафин и тонкие секционирование колонии микробной биопленки. Здесь мы будем описывать подготовки Pseudomonas aeruginosa PA14 колонии биопленки шлифов ^10,11, но мы также успешно применен этот метод к биопленки, образованный бактерии Pseudomonas synxantha, Сенная палочка, и холерный вибрион¹².

Процесс биоплёнки парафин встраивание и тонко секционирования следует простая логика. Во-первых биоплёнки помещены в слое агар для сохранения морфология во время обработки. Во-вторых заключенная биоплёнки погружали в фиксатор чтобы crosslink макромолекул и сохранить микроморфологии. Эти затем обезвоживается с алкоголем, очищаются с более неполярных растворителей и затем проникли с жидкого парафина. После того, как проникли, образцы встроены блоки воск для разрезания. Секции являются вырезать, монтируется на слайдах и затем Регидратированные для того, чтобы вернуть их в более родного государства. С этого момента они могут окрашенных или покрыты в среде установки для микроскопического анализа.

Этот протокол производит шлифов микробной биоплёнки подходит для гистологического анализа. Колонии биопленки подструктурами видны, когда шлифов, подготовлен с использованием этого метода отражаются на световой микроскопии. Биопленки можно также выращивать на СМИ содержащие флуоресцентные пятна специфических для индивидуальных особенностей или витражи на шаге регидратации, непосредственно до монтажа (шаги 9.5-9,6). Наконец микробы могут быть спроектированы для получения флуоресцентных белков в учредительных или регулируется моды, позволяя в situ отчетности распределения или гена выражения ячейки в этих общинах. Мы использовали эти методы для определения глубины биопленки колонии, распределение ячеек, матрица распределения, шаблонов роста и экспрессии генов пространственно-временных.