פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית
Summary
אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.
Abstract
חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין היא טכניקה הוקמה באופן כללי במערכות האיקריוטים. כאן, אנו מספקים שיטה הקיבעון, הטבעה, ואת חלוקתה של biofilms בשלמותם המושבה חיידקים באמצעות perfused פרפין. להתאים שיטה זו לשימוש על המושבה biofilms, אנחנו פיתח טכניקות לשמירה על כל דגימה על מצע הגידול שלה, למינציה זה עם overlayer אגר, נוספו ליזין הפתרון מקבע. אלה אופטימיזציות לשפר את שימור הדגימה של שימור תכונות micromorphological. דוגמאות שהוכנו באופן זה נתונות דק חלוקתה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, זריחה, שידור. אנחנו החלת טכניקה זו המושבה biofilms של Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis ויבריו cholerae. רמה גבוהה של פירוט הגלויות בדגימות שנוצר על ידי שיטה זו, בשילוב עם זן כתבת הנדסה או השימוש של צבע ספציפי, יכול לספק תובנות מרגש הפיזיולוגיה והפיתוח של קהילות מיקרוביאלי.
Introduction
רוב החיידקים יש את היכולת ליצור biofilms, קהילות של תאים מחוזק ע י מטריצות מתוצרת עצמית. ניתן לגדל Biofilms בסוגים רבים של כיוונונים פיזית, עם משטרים שונים של הוראה התזונתי, המצע. מבחני ספציפי עבור ביופילמים נוטים להניב מבנים multicellular לשחזור, ואת לארכיטקטורות נפוצות שנצפו phylogenetically מגוון מינים הקהילה או ברמה מאקרוסקופית. כאשר חיידקים גדלים כמו מושבות בינוני מוצק תחת אווירה, מורפולוגיה מאקרוסקופית מוסרת מידע אודות היכולת לייצור מטריקס, לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם אחרים תכונות 1,2,3. הארכיטקטורה הפנימית של מושבות חיידקים יכולים גם לספק רמזים לגבי כימיה biofilm ספציפיים, פיזיולוגיה, אבל היה קשה לאפיין. היישומים האחרונים של טכניקות cryoembedding ו- cryosectioning למושבות חיידקים אפשרו הדמיה והדמיה של תכונות ספציפיות החלטה חסרת תקדים 4,5,6. עם זאת, מחקרים ברקמות בעלי חיים הראו כי פרפין הטבעה ומוצריה מעולה של מורפולוגיה בהשוואה cryoembedding 7 שימש כדי להמחיש חיידקים רקמות 8,9. לכן פיתחנו פרוטוקול קיבוע, פרפין הטבעה של דק חלוקתה של מושבת חיידקים biofilms. כאן, אנו נתאר את הכנת Pseudomonas aeruginosa PA14 המושבה-biofilm דק סעיפים 10,11, אבל אנחנו גם בהצלחה החלת טכניקה זו biofilms הנוצרת על-ידי החיידק Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ו ויבריו cholerae12.
התהליך של הטמעה-פרפין, דק-חלוקתה biofilms עוקב אחר פשוט הגיון. ראשית, biofilms עטוף בשכבה של אגר לשמר מורפולוגיה במהלך העיבוד. שנית, עטוף-biofilms טובע לשבועיים כדי crosslink מקרומולקולות, לשמר את micromorphology. אלה מכן מיובש עם אלכוהול, פינה עם הממס יותר לא קוטביים הינם הסתננו ואז עם פרפין נוזלי. לאחר שחדר, הדגימות מוטבעים לגושי שעווה על חלוקתה. סעיפים לחתוך, רכוב על שקופיות, ואז ולמיומנות כדי להחזיר אותם למצב יותר מקורי. מנקודה זו, ניתן צבעונית או מכוסה הרכבה בינונית לבדיקה מיקרוסקופית.
פרוטוקול זה מייצר חלקים דקים של חיידקים פתוגנים המועברים במזון מתאים לבדיקה היסטולוגית. המושבה biofilm substructures גלויים כאשר סעיפים דקים שהוכן בשיטה זו הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור. Biofilms יכול להיות גם גדל על כתמי פלורסנט המכיל מדיה ספציפיים עבור תכונות בודדות או צבעונית בשלב התייבשות, מייד לפני הרכבה (שלבים 9.5-9.6). לבסוף, ניתן לתכנן חיידקים כדי לייצר חלבונים פלורסנט אופנה מכוננת או מוסדר ומאפשר בחיי עיר הדיווח של התא הפצה או גנים ביטוי בתוך קהילות אלה. השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע המושבה biofilm עומק תא הפצה, הפצה מטריקס, דפוסי הצמיחה, ייתכן גנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגימות רקמה הטבעה-פרפין, דק-חלוקתה היא טכניקה היסטולוגית הקלאסי מאפשר הדמיה של מבנה מיקרו-מורפולוגי, משמש בדרך כלל על רקמות האיקריוטים ולאחר הוחלה בהצלחה מסוימת על חיידקים דגימות8 ,9. בעוד cryoembedding מאפשר שמירה חזקה של אות אנדוגני, immunofluorescent, פרפין הטבעת היא כל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF הקריירה פרס 1553023 ופרס NIH/NIAID R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
