歯肉の炎症性三次元人体同等
Summary
プロトコルの目的は、炎症性歯肉モデル体外を構築することです。この組織モデルは共同ひと細胞、HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞および三次元条件下での THP 1 マクロファージの 3 種類を栽培します。このモデルは、歯肉炎や歯周炎などの歯周病を調査に適用することができます。
Abstract
(歯肉炎・歯周炎などの歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉の炎症は、歯周疾病の根本的な生理病理学です。歯周疾患の実験モデルを現在は動物の様々 なタイプに設けられています。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患の新薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。ここでは、ヒトの炎症性組織培養歯肉 (日本支社は 1996) 相当を再構築するための詳細なプロトコルを提案する.2 種類のひと歯肉線維芽細胞 (HGF) と三次元条件下でヒトの皮膚表皮角化細胞 (HaCaT) などを含む人間の細胞を用いた人体組織等価な歯肉 (GTE) を構築します。GTE に穴をパンチする組織パンチャーを使用して傷のモデルを作成します。次に、人間の THP 1 球がコラーゲン ・ ゲル混合は、GTE の穴に挿入されます。10 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 72 時間の adimistration、thp-1 細胞では GTE (日本支社は 1996) でフォーム炎症巣にマクロファージ分化 (日本支社は 1996 もすることができます stumilated 2 μ g/ml のリポ多糖 (LPS) の炎症を開始する 48 時間).日本支社は 1996 は、ひと細胞を用いた三次元アーキテクチャ炎症歯肉の最初の in vitroモデルです。日本支社は 1996 は、歯周疾病の主要な病理学的変化 (免疫細胞 activition、fibryoblasts、上皮細胞、単球やマクロファージの細胞相互作用) を反映します。GTE、負傷者 GTE、日本支社は 1996 は、歯周疾病の創傷治癒過程を研究する汎用性の高いツール、組織再生、炎症、細胞間相互作用や画面潜在的な医薬品として使用できます。
Introduction
歯周病は、成人の歯の喪失の主要な原因です。歯肉炎と歯周炎は、最も一般的な歯周疾患です。両方は歯肉でバイオ フィルムを介した急性または慢性炎症性変化を提示します。歯肉炎は、歯周炎は、通常慢性炎症として提示に対し、急性炎症によって特徴付けられます。組織学的レベルでは、微生物の構成要素は、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、肥満細胞の1,2などの免疫細胞の活性化をトリガーします。(歯肉上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞を含む) ローカルの細胞と対話するこれらの免疫細胞、特にマクロファージ炎症歯周組織3,4病変の結果します。ラットなどの動物の様々 な種類の歯周疾患の実験モデルを確立されているハムスター、ウサギ、フェレット、イヌ、霊長類。ただし、モデル動物の生理病理学、細胞および分子メカニズムを分析し、歯周疾患5の新しい薬を評価しにくく、人間のそれとは異なる。歯周病細菌や単分子膜ひと口腔上皮細胞の共同栽培は、歯周感染症6のメカニズムを調査する使用されています。口腔細胞の単層培養がそのまま組織の三次元 (3 D) 細胞アーキテクチャを欠いているにもかかわらず、したがって、培養状況を模倣することはできません。
ここでは、体外で歯周疾患を表す 3 D 炎症人体組織等価な歯肉 (日本支社は 1996) が確立されます。歯周疾患のこの 3 D モデルは、単層細胞培養および動物モデル間の中間位置を占めています。HaCaT ケラチノ サイト、歯肉線維芽細胞、THP 1 マクロファージなどの細胞の 3 種類はコラーゲンのゲルの共同栽培、日本支社は 1996 を構築する炎症性のイニシエーターによって刺激されます。日本支社は 1996 は密接に、細胞分化、細胞間の相互作用、および歯肉組織におけるマクロファージ活性化の生体内での条件をシミュレートします。このモデルは、薬物スクリーニングと歯周疾病の新しい薬理学的アプローチをテストのためだけでなく、創傷治癒、炎症、組織再生で細胞および分子メカニズムを分析するため多くのアプリケーションを持っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、歯肉組織等価および皮下脂肪組織相当前レポート8,21,22で説明を作成する方法に基づいています。これは、シンプルで簡単な方法は、いくつかの手順特別な注意が必要です。たとえば、コラーゲン混合物は、ソリューションのゲル形成を避けるために使用するまで氷で冷やす必要があります。コラーゲ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、科学研究 (26861689, 17 K 11813) の科学振興費日本社会によって一部に支えられました。著者は、校正のナサニエル ・ グリーン氏に感謝したいと思います。
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
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