3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물
Summary
프로토콜의 목적은 염증 인간의 gingiva 모델 시험관을 구축 하는 것입니다. 이 조직 모델 공동 세 가지 유형의 인간 세포, HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP 1 대 식 세포, 3 차원 조건 하에서 양성. 치은 염 및 치 주 염 등 치 주 질환을 조사 하는 것이 모델을 적용할 수 있습니다.
Abstract
치 주 질환 (치은 염 등 치 주 염)는 성인에서 치아 손실의 주요 원인. Gingiva에 염증 치 주 질환의 근본적인 physiopathology입니다. 치 주 질환의 현재 실험 모델 동물의 다양 한 종류에 설립 되었습니다. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환에 대 한 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 여기, 우리 인간의 염증 성 조직 등가물 gingiva (iGTE) 체 외에서의 재구성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 우리는 먼저 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGF) 등 3 차원 조건 하에서 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT), 인간 세포의 두 종류를 이용 하 여 gingiva (GTE)의 인간의 조직에 해당 빌드. 우리는 GTE에 구멍을 펀치 조직 주먹을 사용 하 여 상처 모델을 만듭니다. 다음, 인간의 THP 1 monocytes 콜라겐 젤과 혼합는 GTE에 구멍에 주입 됩니다. 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 72 h에 대 한 adimistration에 의해 THP-1 셀 GTE (iGTE)에서 양식 염증 foci 하 대 식 세포로 분화 (IGTE 또한 일 수 있다 stumilated lipopolysaccharides (LPS)의 2 µ g/mL와 염증을 시작 하 48 h에 대 한 ). IGTE 3 차원 구조와 인간 세포를 사용 하 여 염증 gingiva의 첫 번째 시험관에 모델입니다. IGTE 치 주 질환에 주요 학적 변화 (immunocytes activition, fibryoblasts, 상피 세포, monocytes 그리고 대 식 세포 중에서 세포 상호 작용)을 반영 한다. 치 주 질환에 대 한 상처 치유 공부를 다양 한 도구, 조직 재생, 염증, 세포 세포 상호 작용, 및 화면 잠재적인 약으로 GTE, 부상된 GTE, 및 iGTE을 사용할 수 있습니다.
Introduction
치 주 질환 성인에서 치아 손실의 주요 원인입니다. 치은 염 및 치 주 염 가장 일반적인 치 주 질병이 있습니다. 둘 다 gingiva에 biofilm 중재 급성 또는 만성 염증 성 변화를 제시. 치은 염 치 주 염이 만성 염증으로 일반적으로 선물 하는 반면 급성 염증, 특징 이다. 조직학 수준에 세균성 구성 요소는 대 식 세포, 림프 톨, 플라스마 세포, 돛대 세포1,2등 면역 세포의 활성화를 트리거합니다. 이러한 면역 세포 특히 대 식 세포, 지방 세포 (gingival 상피 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 및 osteoblasts 포함)와 상호 작용 결과로 치 주 조직3,4에 염증 성 병 변. 치 주 질환의 실험 모델 동물, 쥐, 등의 다양 한 종류에서 설립 되어 햄스터, 토끼, 흰 족제비, 개, 그리고 대주교. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환5의 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 치 주 박테리아와 단층 인간 구강 상피 세포의 공동 경작은 치 주 감염6의 메커니즘을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 구강 세포의 단층 문화 부족 그대로 조직;의 3 차원 (3D) 셀룰러 아키텍처 따라서, 그들은 체 외에 상황을 모방 수 없습니다.
여기, 3D 염증 인간의 조직 등가물 gingiva (iGTE)의 생체 외에서치 주 질환을 대표 설정 됩니다. 치 주 질환의이 3D 모델 단층 세포 배양 및 동물 모델 사이의 중간 위치를 차지 하고있다. 세 가지 유형의 HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP-1 세포를 포함 하 여 인간 셀 공동 콜라겐 젤에 재배 있으며 iGTE 구축 염증 초기자에 의해 자극. IGTE는 밀접 하 게 세포 분화, 세포 세포 상호 작용 및 gingiva에 대 식 세포 활성화의 비보에 조건을 시뮬레이션합니다. 이 모델은 마약 검사 및 치 주 질환, 새로운 약리학 접근을 테스트 뿐만 아니라 상처 치유, 염증, 및 조직 재생에 세포질이 고 분자 메커니즘 분석을 위한 많은 가능한 응용.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 gingival 조직 등가물 및 이전 보고서8,,2122에 의해 설명 된 피하 지방 조직 등가물을 만드는 방법을 기반으로 합니다. 이 간단 하 고 쉬운 방법 이지만, 일부 단계 특별 한 주의가 필요 합니다. 예를 들어 콜라겐 혼합 솔루션에서 젤 형성을 피하기 위해 사용 될 때까지 얼음에 유지 되어야 한다. 문화 삽입으로 콜라겐 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 지원 부분에서 일본 사회에 의해 과학 진흥 (JSP) 선진적인 과학 연구 (26861689 및 17 K 11813) 한다. 저자 나 다니엘 그린 씨 교정 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
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