Summary

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Published: March 11, 2018
doi:

Summary

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed – hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

Abstract

Ischemische beroerte leidt tot vasogenic hersenoedeem en latere primaire hersenletsel, dat is bemiddeld door vernietiging van de bloed – hersenbarrière (BBB). Ratten met geïnduceerde ischemische beroerte werden opgericht en gebruikt als in vivo modellen te onderzoeken van de functionele integriteit van de BBB. Spectrofotometrische detectie van Evans blauw (EB) in de hersenen monsters met ischemische schade kon betrouwbare overleggen voor onderzoek en ontwikkeling van nieuwe therapeutische modaliteiten. Deze methode reproduceerbare resultaten oplevert, en is van toepassing in een laboratorium zonder de behoefte aan speciale apparatuur. Hier presenteren we een gevisualiseerde en technische richtsnoer op de detectie van de extravasation van EB na inductie van ischemische beroerte bij ratten.

Introduction

Vasogenic oedeem van de hersenen als gevolg van verstoring van de bloed – hersenbarrière (BBB) blijft een belangrijke complicatie van de ischemische beroerte en een belangrijke determinant van de overlevingskansen in de beroerte patiënten1,2. De bloed – hersenbarrière (BBB), die is gevormd door hersenen capillaire endotheliale cellen (BCECs) en bestaat uit verschillende neurovasculaire componenten (BV, strakke kruispunten tussen BCECs, pericytes, astroglial en neuronale cellen3), biedt een gespecialiseerde en dynamische interface tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en perifere bloed-circulatie4,5. Beledigingen zoals ischemie-reperfusie verwondingen kon de functionele integriteit van de BBB verstoren en leiden tot verdere penetratie van circulerende leukocyten in de hersenen parenchym die uiteindelijk leiden tot cerebrale ontsteking en primaire hersenletsel 6 , 7. dierlijke modellen nodig zijn voor de exacte detectie van de dysfunctie van BBB na optreden van een beroerte. Dergelijke modellen zijn van groot belang voor het bestuderen van de onderliggende pathofysiologische mechanismen en de invoering van nieuwe neuroprotectieve strategieën. In vitro cel cultuur gebaseerde modellen van de BBB zijn sterk ontwikkeld en gebruikt voor moleculaire studie van de BBB fysiopathologie8,9,10. In vivo diermodellen, die ischemische schade van de BBB vergelijkbaar met menselijke klinische omstandigheden produceren, zijn echter ook zeer de moeite waard in dit opzicht. Kwantitatieve detectie van de extravasation van Evans blauw (EB) is een goed aanvaard en gevoelige techniek die is gebruikt voor beoordeling van de BBB integriteit en functie in neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van ischemische beroerte11, 12 , 13 , 14. deze methode is kosteneffectief, haalbaar, reproduceerbaar, en volledig toepasbaar in een experimenteel laboratorium. De uitvoering ervan vereist geen geavanceerde apparatuur, zoals radioactieve tracers15 of magnetische resonantie beeldvorming (MRI)16, dat zijn voorwaarden voor andere methoden. In dit artikel tonen we uitvoerig elementaire technische processen van BBB beoordeling EB extravasation met rat modellen van ischemische beroerte.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van Ardabil University of Medical Sciences Research Council voor het uitvoeren van dierproeven (ethische id-nummer: IR. ARONSKELKEN. REC.1394.08). In deze gevisualiseerde studie, gebruikten we volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (300-350 g) verkregen uit grasland Instituut (Teheran, Iran). 1. narcose en flowmetrie Anesthesie met 4% Isofluraan induceren en onderhouden met Isofluraan (1-1,5%) in een mengsel van lac…

Representative Results

Er was geen significant verschil in EB niveaus in de rechter hersenhelft ten opzichte van de linker hemisfeer van de sham bediende rats (1.06 ± 0,1 µg/g en 1,1 ± 0.09 µg/g, respectievelijk). Zoals in figuren 2A-2B, inductie van voorbijgaande ischemie (90 min ischemie / reperfusie 24u) veroorzaakt een significant verschil in EB niveaus (10.41 ± 0.84 µg/g, p < 0.001) in de linker hemisfeer van ischemische ratten, ten opzichte van de respectieve halfrond in de…

Discussion

Tot nu toe diverse methoden zoals autoradiografie en opsporing van de radioactieve tracers24,25, immunofluorescentie microscopie26,27, en EB extravasation techniek20, 23 zijn gebruikt voor het evalueren van de schade van de bloed – hersenbarrière. EB kleurstof vermag sterk binden aan de serumalbumine en wordt gebruikt als een tracer voor vascula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn dankbaar de Vice-kanselier voor onderzoek van de Ardabil Universiteit van medische wetenschappen (Ardabil, Iran) voor de financiële ondersteuning (No verlenen: 9607).

Materials

Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 – 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

References

  1. Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39 (9), 2538-2543 (2008).
  2. Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 399-415 (2003).
  3. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 33, 379-408 (2010).
  4. Zhang, C., et al. The potential use of H102 peptide-loaded dual-functional nanoparticles in the treatment of Alzheimer’s disease. J Control Release. , (2014).
  5. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  6. Fang, W., et al. Attenuated Blood-Brain Barrier Dysfunction by XQ-1H Following Ischemic Stroke in Hyperlipidemic Rats. Mol Neurobiol. 52 (1), 162-175 (2015).
  7. Huang, J., et al. CXCR4 antagonist AMD3100 protects blood-brain barrier integrity and reduces inflammatory response after focal ischemia in mice. Stroke. 44 (1), 190-197 (2013).
  8. Omidi, Y., Barar, J. Impacts of blood-brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors. Bioimpacts. 2 (1), 5-22 (2012).
  9. Cho, H., et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 5, (2015).
  10. Barar, J., Rafi, M. A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Blood-brain barrier transport machineries and targeted therapy of brain diseases. Bioimpacts. 6 (4), 225-248 (2016).
  11. Kaya, M., et al. Magnesium sulfate attenuates increased blood-brain barrier permeability during insulin-induced hypoglycemia in rats. Can J Physiol Pharmacol. 79 (9), 793-798 (2001).
  12. Pasban, E., Panahpour, H., Vahdati, A. Early oxygen therapy does not protect the brain from vasogenic edema following acute ischemic stroke in adult male rats. Sci Rep. 7 (1), 3221 (2017).
  13. Haghnejad Azar, A., Oryan, S., Bohlooli, S., Panahpour, H. Alpha-Tocopherol Reduces Brain Edema and Protects Blood-Brain Barrier Integrity following Focal Cerebral Ischemia in Rats. Med Princ Pract. 26 (1), 17-22 (2017).
  14. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  15. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-antibody autoradiography and peptide fragments of albumin in cerebral edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  16. Jiang, Q., et al. Quantitative evaluation of BBB permeability after embolic stroke in rat using MRI. J Cereb Blood FlowMetab. 25 (5), 583-592 (2005).
  17. Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J Vis Exp. (48), (2011).
  18. Hungerhuber, E., Zausinger, S., Westermaier, T., Plesnila, N., Schmid-Elsaesser, R. Simultaneous bilateral laser Doppler fluxmetry and electrophysiological recording during middle cerebral artery occlusion in rats. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 109-115 (2006).
  19. Panahpour, H., Nouri, M. Post-Ischemic Treatment with candesartan protect from cerebral ischemic/reperfusioninjury in normotensive rats. Int J Pharm Pharm Sci. 4 (4), 286-289 (2012).
  20. Panahpour, H., Dehghani, G. A., Bohlooli, S. Enalapril attenuates ischaemic brain oedema and protects the blood-brain barrier in rats via an anti-oxidant action. Clin Exp Pharmacol Physiol. 41 (3), 220-226 (2014).
  21. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Blockade of Central Angiotensin II AT1 Receptor Protects the Brain from Ischemia/Reperfusion Injury in Normotensive Rats. Iran J Med Sci. 39 (6), 536-542 (2014).
  22. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Candesartan attenuates ischemic brain edema and protects the blood-brain barrier integrity from ischemia/reperfusion injury in rats. Iran Biomed J. 18 (4), 232-238 (2014).
  23. Kaya, M., et al. The effects of magnesium sulfate on blood-brain barrier disruption caused by intracarotid injection of hyperosmolar mannitol in rats. Life sci. 76 (2), 201-212 (2004).
  24. Schöller, K., et al. Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats. Brain Res. 1142, 237-246 (2007).
  25. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-Antibody Autoradiography and Peptide Fragments of Albumin in Cerebral Edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  26. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  27. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  28. Kucuk, M., et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 71 (8), 937-946 (2002).
  29. Uyama, O., et al. Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (2), 282-284 (1988).
  30. Kleinig, T. J., Vink, R. Suppression of inflammation in ischemic and hemorrhagic stroke: therapeutic options. Curr Opin Neurol. 22 (3), 294-301 (2009).
  31. Del Zoppo, G. J., Mabuchi, T. Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (8), 879-894 (2003).
  32. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  33. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  34. Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  35. Bottiger, B. W., et al. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65 (2), 135-142 (1999).

Play Video

Cite This Article
Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

View Video