Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих
Summary
Это метод для выявления роман белков, ДНК взаимодействия в конкретных локусов, полагаясь на захват последовательности конкретных высокоструктурированные chromatin для последующих протеомного анализа. Без предварительных знаний о потенциальных связывания белков, ни ячейку изменения являются обязательными. Изначально разработанный для дрожжей, технология теперь была адаптирована для клеток млекопитающих.
Abstract
Захват гибридизации хроматина связанных белков для протеомики (HyCCAPP) технологии был первоначально разработан раскрыть Роман ДНК белковых взаимодействий в дрожжей. Это позволяет проводить анализ целевого региона интерес без необходимости предварительного знания о вероятно белки, привязан к целевой области. Это, в теории, позволяет HyCCAPP использоваться для анализа любого геномной региона интерес, и она обеспечивает достаточную гибкость для работы в различных клеточных системах. Этот метод не предназначен для изучения привязки сайтов известных транскрипционных факторов, задач лучше подходит для иммунопреципитации Chromatin (обломока) и чип подобных методов. HyCCAPP сила в его способность исследовать ДНК регионов, для которых ограничено или нет знаний о связанных с ним белков. Она также может быть удобный метод, чтобы избежать смещения (присутствует в чип как методы) введены на основе белка хроматина обогащения с использованием антител. Потенциально HyCCAPP может быть мощным инструментом для выявления действительно Роман ДНК белковых взаимодействий. На сегодняшний день технология преимущественно применяется для дрожжевых клеток или высокой копии повторения последовательностей в mammalian клетках. Для того чтобы стать мощным инструментом, который мы видим, HyCCAPP подходы должны быть оптимизированы для эффективного захвата поштучными локусов в mammalian клетках. Здесь мы представляем наши адаптации первоначального дрожжей HyCCAPP захватить протокол для линий клеток человека и показать, что поштучными хроматина регионы могут быть эффективно изолированы с этого измененного Протокола.
Introduction
В течение последнего десятилетия произошло резкое улучшение в последовательности технологий, позволяя изучение широкого круга геномов в большом количестве образцов и с удивительной резолюцией. Консорциум Энциклопедия элементов ДНК (кодирования), крупномасштабные межучрежденческие усилия под руководством национального человеческого генома научно-исследовательского института национальных институтов здравоохранения, предоставил понимание как отдельные факторы транскрипции и других регуляторных белков связывать и взаимодействовать с геном. Первоначальные усилия охарактеризовал конкретные ДНК белковых взаимодействий, как оцениваются иммунопреципитации Chromatin (обломока) для более чем 100 известных ДНК связывающих белков1. Альтернативные методы, такие как footprinting DNase2 и формальдегида помощь изоляции регуляторных элементов (ФЭР)3 также были использованы для обнаружения конкретных областей генома, взаимодействующих с белками, но с очевидным ограничением, Эти экспериментальные подходы не идентифицируют взаимодействуя белками. Несмотря на обширные усилия за последние годы технология не возникло, эффективно позволяет всеобъемлющего квалификация взаимодействий протеин дна хроматина, и идентификации и количественного определения связанных хроматина белков.
Для удовлетворения этой потребности, мы разработали новый подход, который мы назвать Hybridization Capture of Chromatin-Associated белки для протеомики (HyCCAPP). Изначально разработанный в дрожжи4,5,6, подход изолирует высокоструктурированные хроматина регионы интереса (с связанных белков) с помощью захвата последовательности конкретных гибридизации. После изоляции ДНК белковых комплексов подходы, как масс-спектрометрии может использоваться для характеристики набор белков, обязан последовательность интереса. Таким образом HyCCAPP может рассматриваться как беспристрастного подхода к раскрыть Роман ДНК белковых взаимодействий, в том смысле, что она не полагаться на антитела и он полностью агностиком о белки, которые могут быть найдены. Существуют другие подходы способны раскрыть Роман ДНК взаимодействуют белки7, но наиболее полагаться на чип как методы8,9,10, плазмида вставки11,12, 13,14, или регионов с высоким копировать номера15. В противоположность этому HyCCAPP может быть применен к мульти – и поштучными регионов, и она не требует никакой предварительной информации о белки в регионе. Кроме того, в то время как некоторые из методов упоминалось выше есть ценные функции, в частности избегая необходимости для ДНК белковых реакций сшивки, уникальной особенностью HyCCAPP является, что он может применяться к одной копии регионов в неизмененной клетки и без каких-либо предварительных знаний о предполагаемого связывания белков, или доступные антител.
На данный момент HyCCAPP преимущественно был применен к анализу различных регионах геномной дрожжи4,5,6и недавно был использован для анализа ДНК белковых взаимодействий в альфа спутник ДНК, повторите региона в геноме человека16. Как часть нашей текущей работы мы адаптировали подход захвата гибридизации, изначально разработанный для дрожжей хроматина применяться для анализа клеток человека, и здесь представить измененный Протокол, который позволяет селективного захват одной копии целевой регионы в геноме человека с эффективность похож на наши первоначальные исследования в дрожжей. Этот новый оптимизированный протокол теперь позволяет адаптации и использования технологии допросить взаимодействий протеин дна через генома человека, с помощью масс-спектрометрии или другие аналитические подходы.
Важно подчеркнуть, что метод HyCCAPP предназначен для анализа конкретных целевых областей и пока не подходит для анализа генома широкий. Эта технология особенно полезна при работе с регионами, для которых есть скудные сведения о взаимодействуя белками, или когда требуется более полный углубленный анализ взаимодействия белков в локусе конкретным геном. HyCCAPP предназначен для выявления ДНК связывающих белков, но не точно характеризуют сайтов связывания определенных белков в геномной ДНК. В своей текущей реализации методологии не предоставляют информацию о последовательности ДНК привязки или мотивы для индивидуальных белков. Таким образом он красиво дополняет существующие технологии, такие как FAIRE и может позволить выявление Роман связывания белков в регионах геномной выявленные первоначальный анализ FAIRE.
Protocol
Representative Results
Discussion
HyCCAPP метод, описанный здесь имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощным подход для выявления ДНК взаимодействий, которые в противном случае будет оставаться недостижимой. Характер процесса дает HyCCAPP возможность работы в различных организмов и регионах генома. Это ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грантов P50HG004952 и R01GM109099 в MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
