עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים
Summary
זוהי שיטה לזיהוי חלבונים אינטראקציה-DNA הרומן ב לוקוסים יעד ספציפיות, בהסתמך על רצף ספציפי לכידתו של כרומטין תפור עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית עוקבות. ידע מוקדם לגבי פוטנציאל מחייב חלבונים, ולא תא שינויים נדרשים. בתחילה פותח עבור שמרים, הטכנולוגיה כבר עכשיו מותאם בתרבית של תאים.
Abstract
התפיסה הכלאה של חלבוני כרומטין-הקשורים לטכנולוגיה פרוטאומיקס (HyCCAPP) פותחה בתחילה לחשוף את הרומן אינטראקציות חלבון-דנ א של שמרים. היא מאפשרת ניתוח של אזור היעד עניין ללא צורך ידע מוקדם על חלבונים סביר מאוגד לאזור היעד. זה, באופן תיאורטי, מאפשר HyCCAPP לשמש כדי לנתח בכל אזור גנומית של עניין, והוא מספק גמישות מספקת לעבודה במערכות תאים שונים. שיטה זו לא נועד ללמוד אתרי קישור של גורמי שעתוק ידוע, פעילות מתאימה יותר Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ושיטות כמו שבב. כוחו של HyCCAPP טמונה היכולת לחקור את אזורי ה-DNA אשר יש מוגבלת או לא ידע על החלבונים המאוגד. זה יכול להיות גם שיטה נוחה כדי למנוע הטיות (קיים בשיטות כמו צ’יפס) שהוצגו על ידי חלבון מבוססת כרומטין העשרה באמצעות נוגדנים. באופן פוטנציאלי, HyCCAPP יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחשוף את הרומן באמת אינטראקציות חלבון-דנ א. עד היום, הטכנולוגיה הוחל בעיקר תאי שמרים או העתק גבוהה רצפים חוזרים בתאי יונקים. כדי להפוך כלי רב עוצמה שנוכל לדמות, גישות HyCCAPP צריך ניתן למטב ללכוד ביעילות עותק יחיד לוקוסים בתאי יונקים. כאן, אנו מציגים שלנו הסתגלות של השמרים הראשונית HyCCAPP ללכוד את פרוטוקול שורות תאים אנושיים, ולהראות כי אזורים כרומטין עותק יחיד יכול להיות יעילה מבודדת עם פרוטוקול זה שונה.
Introduction
במהלך העשור האחרון, ראה שיפור דרמתי בטכנולוגיות רצף, המאפשר הלימוד של מגוון רחב של הגנום במספר גדול של דוגמאות, ועם רזולוציה מדהימה. הקונסורציום האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד), מאמץ רב מוסדיים בקנה מידה גדול ובאסטרטגיות האנושי הגנום מחקר המכון הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים, סיפקה תובנות גורמי שעתוק כמה בודדים אחרים חלבוני לאגד ולתקשר עם הגנום. המאמץ הראשוני מאופיין אינטראקציות חלבון-דנ א ספציפי, כפי שקובעת מאת immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מעל 100 ידוע DNA מחייב חלבונים1. שיטות אלטרנטיביות כגון DNase footprinting2 , פורמלדהיד בידוד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם)3 גם שימשו כדי לאתר אזורים ספציפיים בגנום אינטראקציה עם חלבונים, אבל עם המגבלה ברור זה גישות אלה אינם מזהים את החלבונים אינטראקציה. למרות המאמצים במהלך השנים, התפתחה שום טכנולוגיה המאפשרת ביעילות אפיון מקיף של אינטראקציות חלבון-DNA כרומטין, זיהוי, כימות של חלבונים הקשורים כרומטין.
כדי לטפל צורך זה, פיתחנו גישה מוזרה אשר אנחנו כינה Hybridization Capture of Chromatin-Associated חלבונים עבור פרוטאומיקס (HyCCAPP). שפותחה לראשונה שמרים4,5,6, הגישה מבודד אזורים של כרומטין תפור עניין (עם חלבונים מאוגד) באמצעות לכידת הכלאה רצף ספציפי. לאחר בידוד של קומפלקסים חלבונים-DNA, גישות כגון ספקטרומטר מסה יכול לשמש כדי לאפיין את קבוצת חלבונים מאוגד רצף של עניין. לפיכך, HyCCAPP יכול להיחשב גם בגישה לבחון לחשוף את הרומן אינטראקציות חלבון-דנ א, מובן כי אין להסתמך על נוגדנים וזה לגמרי אגנוסטי על החלבונים שעשויים להימצא. ישנן גישות אחרות מסוגל לחשוף את הרומן חלבונים אינטראקציה דנ א7, אבל הכי להסתמך על שיטות כמו צ’יפס8,9,10, פלסמיד הוספות11,12, 13,14, או אזורים עם העתק גבוהה מספרים15. לעומת זאת, ניתן להחיל HyCCAPP multi-יחיד-להעתיק אזורים, היא אינה דורשת כל מידע מוקדם על החלבונים באזור. בנוסף, בעוד חלק מהשיטות שהוזכרו לעיל יש תכונות יקר, ובייחוד ולהימנע מהצורך חלבון-דנ א crosslinking תגובות, התכונה הייחודית של HyCCAPP היא כי ניתן להחיל אותה על אזורים עותק יחיד ב יבוצעו בהם שינויים תאים, וללא כל ידע מוקדם על חלבונים בשם איגוד, או נוגדנים זמינים.
בשלב זה, HyCCAPP בעיקר הוחלה על הניתוח של אזורים שונים גנומית שמרים4,5,6, שימש לאחרונה ניתוח אינטראקציות חלבון-DNA ב- DNA אלפא-לווין, באזור חוזר הגנום האנושי16. במסגרת העבודה השוטפת שלנו, אנחנו הסתגלו הגישה לכידת הכלאה שפותחה לראשונה על שמרים כרומטין להיות רלוונטי לניתוח של תאים אנושיים, להציג כאן ששונה פרוטוקול המאפשר לכידת סלקטיבי היעד עותק יחיד אזורים בהגנום האנושי בעזרת יעילות דומה שלנו מחקרים ראשוניים של שמרים. פרוטוקול ממוטבת חדש זה מאפשר כעת את הסתגלות וניצול מיטבי של הטכנולוגיה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA ברחבי הגנום האנושי, באמצעות ספקטרומטר מסה או גישות אנליטיות אחרות.
חשוב להדגיש כי השיטה HyCCAPP מיועד לניתוח של אזורים ספציפיים, עדיין אינו מתאים ניתוח הגנום כולו. הטכנולוגיה היא שימושית במיוחד בעת התמודדות עם אזורים אשר יש מידע נדיר על חלבונים אינטראקציה או בעת ניתוח מעמיק ומקיף יותר של חלבונים אינטראקציה-לוקוס הגנום ספציפי רצוי. HyCCAPP נועד לחשוף DNA מחייבת חלבונים אבל לא לאפיין במדויק את האתרים מחייב חלבון ספציפי ב- DNA גנומי. ביישומה הנוכחי, המתודולוגיה אינו מספק מידע אודות רצפי דנ א איגוד או מוטיבים חלבונים בודדים. לכן, זה יפה משלימה את טכנולוגיות קיימות כגון שלהם, עשוי לאפשר זיהוי מחייב הרומן חלבונים באזורים גנומית המזוהה על-ידי ניתוח ראשוני שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת HyCCAPP המתוארים כאן יש תכונות ייחודיות רבות, המאפשרות גישה רב-עוצמה לחשוף את הדנ א-אינטראקציות אחרת הייתם נשארים חמקמקים. מהות התהליך נותן HyCCAPP את הגמישות לעבוד אורגניזמים שונים והאזורים של הגנום. זו שיטה, עם זאת, יש מספר מגבלות כדי להיחשב.
HyCCAPP היא שיטה אשר ימנע שינויים תא …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים P50HG004952 ו- R01GM109099 כדי מו
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
