Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS
Summary
Aqui, apresentamos duas novas metodologias, psPACT e mPACT, para alcançar a máxima transparência óptica e posterior análise microscópica da vascularização do tecido no roedor intacta toda CNS.
Abstract
Desde o desenvolvimento de clareza, uma bioelectrochemical técnica de compensação que permite mapeamento tridimensional fenótipo dentro de tecidos transparentes, uma multiplicidade de metodologias de romance clareira incluindo cúbico (imagens do cérebro desobstruído, desobstruído cocktails e análise computacional), SWITCH (todo o sistema de controle de tempo de interação) e cinética de produtos químicos, mapa (análise ampliada da proteoma) e Pacto (técnica de clareza passiva), foram criadas para expandir ainda mais o conjunto de ferramentas existente para a análise microscópica de tecidos biológicos. O presente estudo tem por objetivo aperfeiçoar e otimizar o procedimento original do pacto para uma matriz de tecidos de roedores intactas, incluindo a todo sistema de nervoso central (SNC), rins, baço e embriões do rato inteiro. Denominado psPACT (processo-separe pacto) e mPACT (Pacto modificado), essas novas técnicas fornecem meios altamente eficazes de circuitos de célula de mapeamento e visualização de estruturas subcelulares em tecidos normais e patológicos intactas. No protocolo a seguir, apresentamos um esboço detalhado, passo a passo sobre como conseguir autorização de tecido máxima com o mínimo de violação de sua integridade estrutural através de psPACT e mPACT.
Introduction
Dos objectivos fundamentais do inquérito científico e clínico envolve alcançar uma compreensão completa da estrutura do órgão e função; no entanto, a natureza extremamente complexa de mamíferos órgãos muitas vezes serve como uma barreira para atingir plenamente este objectivo1. CLAREZA (lipídios clara-trocadas acrilamida-hibridizado rígida de imagem compatível com tecidos-hidrogel)2,3,4, que envolve a construção de um híbrido baseado em acrilamida hidrogel de tecidos intactos, alcança acesso óptico de uma variedade de órgãos, incluindo o cérebro, fígado e baço, preservando sua integridade estrutural5. CLAREZA, portanto, permitiu não só a visualização, mas também a oportunidade de dissecar finamente complexas redes celulares e morfologias de tecido sem a necessidade de seccionamento.
Para alcançar o apuramento de tecido, clareza emprega métodos eletroforético para remover o conteúdo lipídico da amostra à mão. Enquanto a clareza tem sido notada por produzir híbridos de tecido-hidrogel fisicamente estável, estudos têm demonstrado que seu uso de métodos de compensação (ETC) de tecido eletroforética produz resultados variáveis em termos de qualidade de tecido, incluindo alourar, epítopo danos, e proteína perda5,6. Para solucionar esses problemas, protocolos modificados como Pacto (passivo clareza técnica), que substitui o tratamento ETC com uma técnica passiva, detergente iônico-baseado delipidation, têm sido desenvolvidos7,8,9. Apesar de atingir uma maior consistência nos resultados, no entanto, o pacto exige mais tempo para obter máxima abertura. Além disso, nenhuma destas técnicas ainda foram aplicadas a todo o formulário do CNS, ou em modelos maiores de roedores como ratos e cobaias.
O presente estudo pretende abordar estas limitações, propondo metodologias romance, psPACT (processo-separe pacto) e mPACT (Pacto modificado), para facilitar o rápido desembaraço do CNS inteiro e órgãos internos em tanto o rato e o rato modelos10. Especificamente, psPACT processos de tecidos em acrilamida 4% e 0,25% VA-044 em duas etapas distintas durante a formação de hidrogel; mPACT essencialmente envolve as mesmas etapas, mas complementa a solução baseada em SDS clareira com 0,5% de α-thioglycerol como um reagente chave. Ambas as técnicas aproveitar o endógeno sistêmico e uidos circulatório para reduzir significativamente o tempo necessário para produzir afastamento óptico. Como prova de princípio, vamos mostrar o uso da microscopia confocal para analisar padrões de vasos sanguíneos nos tecidos limpos10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto os métodos de extração passiva, não-eletroforética empregado no Pacto melhorou significativamente a consistência alcançada com tecido anterior limpando métodos tais como clareza,2,3,4,7 , 8, a técnica ainda tem várias deficiências, o mais urgente do que é o período de tempo necessário para atingir o tecido máxima clareza<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo projeto cérebro Coreia 21 PLUS para ciências médicas, Universidade de Yonsei. Além disso, este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
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