MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。
明快さの開発以来らせんの技術をクリアできる透明な組織内三次元表現型写像立方 (明確な遮るもののない脳イメージングを含む新規クリア方法論の多数カクテルと解析) スイッチ (対話時間のシステム全体にわたるコントロール) および化学物質の体内動態、マップ (拡大、プロテオーム解析)、および協定 (受動的な明快さテクニック)、更なる拡大のため既存のツールキットに確立されています。生体組織の顕微解析。本研究の目的を改善し、全体の中枢神経系 (CNS)、腎臓、脾臓、および全体のマウス胚を含む無傷の齧歯動物組織の配列の元の協定の手順を最適化します。PsPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定) と呼ばれる、これらの手法は、細胞回路をマッピングとそのまま正常および病的組織における細胞内の構造を視覚化する非常に有効な手段を提供します。次のプロトコルの psPACT と mPACT を介して構造完全性の最小の侵入と最大組織クリアランスを実現する方法について詳細なステップバイ ステップの概要を提供します。
科学的・臨床的調査の基本的な目的を含む器官の構造と機能の完全な理解を達成します。ただし、哺乳類の器官の非常に複雑な性質はしばしば完全に1この目的を達成するために障壁として機能します。透明度 (明確な脂質交換アクリルアミド ハイブリダイズ剛体イメージング互換かみしめハイドロゲル)2,3,4、そのまま組織からアクリルアミド ベース ハイドロゲル ハイブリッドを構築する関係を実現します。その構造的な整合性の5を維持しながら脳、肝臓、および脾臓を含む臓器の様々 な光のクリアランス。明快さは可視化だけでなく、複雑な携帯電話ネットワークとを区分することがなく組織形態を細かく分析する機会に従ってきました。
組織クリアランスを達成するために明快さは、手でサンプルの脂質含量を削除する電気泳動法を採用しています。電気泳動の組織の清算 (など) の方法を使用が褐変、エピトープ損傷を含む組織品質の面で様々 な結果を生成することを研究で示されている明快さは物理的に安定した組織ハイドロゲルのハイブリッド車を生産するために注目されている中、蛋白質の損失の5,6。これらの問題に対処するため、パッシブ、イオン洗剤ベース脱脂法など治療に置き換えます、協定 (受動的な明快さ技術) などのプロトコルの修正は先進7,8,9をされています。にもかかわらず、結果の一貫性を達成するため、ただし、協定は最大の認可を得るためのより多くの時間を必要です。さらに、これらの技術のどれもが、CNS フォーム全体またはラット、モルモットなど大きい齧歯動物モデルで適用まだされています。
本研究は、psPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定)、全体の中枢神経系と内臓マウスとラットの両方のモデルのための10の高速のクリアランスを促進するための新規方法論を提案し、これらの制限に対処しようとします。具体的には、psPACT プロセス 0.25% と 4% アクリルアミド組織ハイドロゲル形成; 中に 2 つの別々 の手順で VA-044mPACT は基本的に同じ手順が含まれますが、0.5% α-チオグリセ キー試薬として、SDS 決済ソリューションのサプリメントします。両方の技術は、光クリアランスを生成するために必要な時間を大幅に削減する内因性の全身と脳脊髄液循環システムを活用します。原理の証拠として我々 はクリア組織10血管パターンを分析する共焦点顕微鏡の使用を示します。
大幅改善の前の組織をわかりやすく2,3,4、7等をクリアで達成一貫性協定受動的、非電気泳動抽出方法に勤めている間,8テクニックが最も急を要するが最大組織明確12を達成するために必要な時間の長さ、いくつかの欠点はいまだに。現在の研究では、組?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、延世大学医科学脳韓国 21 プラス プロジェクトによって支えられました。さらに、この作品は、韓国の国立研究財団 (NRF-2017R1D1A1B03030315) からの助成金によって支えられました。
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |