Summary

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

Published: April 06, 2019
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Summary

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

Abstract

식품 및 천연 제품에 생리 활성 구성 요소 분석 전통적인 중국 의학 및 식품 안전/독극물을 포함 한 많은 분야에서 연구의 인기 지역이 되었다. 고전 분석 기술의 많은 고가의 장비 및 전문 지식이 필요합니다. 특히, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 식품 및 천연 제품의 분석에 대 한 새로운 방법 되고있다. 이 방법은 항 체 중재 탐지 대상 구성 요소를 기반으로 합니다. 그러나, 많은 자연 제품에서 생리 활성 구성 요소는 작은 (< 1000 다)와 면역 반응을 유도 하지 마십시오, 그들에 대하여 단일 클론 항 체 (mAbs)을 만드는 것은 종종 어려운. 이 프로토콜 mAbs에 대 한 분자를 대상으로 여러 샘플에서 화합물의 빠른 분석에 대 한 관련된 간접 경쟁 (ic) ELISA를 만드는 데 필요한을 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 절차 인공 항 원 (즉, hapten-운반대 공액)의 합성, 면역, 세포 융합, 단일 클로 널 hybridoma 준비, mAb, 특성화 고는 mAb의 ELISA 기반 응용 프로그램에 설명합니다. Hapten-운반대 공액 나트륨에 의해 합성 되었다 메서드를 periodate 하 고 MALDI TOF MS에 의해 평가. 예방 접종, 후 splenocytes 가장 높은 항 체 titer로 면역된 한 마우스에서 고립 되었고 hypoxanthine aminopterin 티 미 딘 (모자)-민감한 마우스 myeloma 세포 선 s p 2/0-Ag14 융합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 사용 하 여-방법을 기반으로. Hybridomas 은닉 mAbs 대상 항 원에 반응 특이성 및 분에 대 한 icELISA에 의해 상영 했다. 또한, 제한 희석 메서드는 단일 클로 널 hybridomas 준비에 적용 되었습니다. 최종 mAbs icELISA 특징 추가 되었고 예제 hapten (naringin (NAR)) 자연 제품에서의 신속 하 고 편리한 검출 ELISA 기반 응용 프로그램에서 활용.

Introduction

단일 클론 항 체 (mAbs), 모노-특정 항 체로 알려진 단일 B-lymphocyte 복제에서 생산 되며 모두 동일한 epitope1에 바인딩할 여러차례 항 체의 구성. 최근 몇 년 동안, 많은 약 식물 유래 천연 제품2다양 한 질병 치료에 사용 되었습니다. 실제로, 원래 천연 제품에서 파생 된 많은 작은 분자 화합물 artemisinin 말라리아와 암2,3paciltaxel (taxol) 등 첫 줄 약으로 이제 적용 됩니다. 천연 제품의 연구는 엄청난 개발 및 기존의 분석 기술, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분석 (MS) 등의 최적화 때문에 크게 급속 한 진행을 했다. 그러나, 아직도 이러한 방법으로, 그들의 복잡 한 전처리 프로토콜, 시간, 노동/전문 지식, 및 필요한 악기4에 관하여 관련된 비용 등 관련 된 몇 가지 제한 사항이 있습니다.

최근, mAb 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISAs) 질적 및 양적 분석 음식과 자연 제품 적용 되었습니다. 사실,이 생물 학적 샘플 분석 및 임상 테스트에 적용 된 방법과 또한 다른 분석5와 관련 된 지루한 전처리 단계를 피하 면 서, 민감한, 정확 하 고 고효율로 표시 되었습니다. 6.

MAb 기반 ELISAs를 사용 하 여 복잡 한 천연물 연구, 단일 클론 항 체의 준비 핵심 단계 중 하나입니다. 불행히도, 이러한 유형의 물질6,7,,89,10,11,12에 작은 bioactive 구성 요소에 특정 mAbs ,13,,1415 는 제한 된 단백질 항 원에 비해. 이 문제를 회피, 특히 작은 화합물에 대하여 mAbs를 생성 하는 프로토콜을 개발 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 합성 인공 항 원, 마우스 면역, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 단일 클로 널 hybridoma 준비 포함 됩니다.

특히, 우리의 연구 그룹 mAbs 전통 중국 의약품에서 작은 생리 활성 화합물에 대 한 형성을 공부 하 고 수년간 그들의 애플 리 케이 션을 개발 되었습니다는. 우리의 지속적인 연구에 mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic 산18, paeoniflorin19, ginsenoside 다시20, ginsenoside Rh121, 그리고 다른 많은 작은 분자에 대 한 개발 했습니다. 이러한 mAbs에 따라 우리의 ELISA 프로토콜 연구의 숫자에 다른 생리 활성 화합물과 그들의 상호 작용으로 이러한 작은 분자의 약 동학을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 이러한 mAbs를 사용 하 여, 우리는 또한 개발 immunoaffinity 착 색 인쇄기 방법 epimers를 포함 하 여 구조상 아날로그의 분리에 대 한. 최근에, 우리는 우리의 안티-puerarin mAb 이후에 급속 하 고, 현장이 화합물의 검출에 사용 된를 사용 하 여 측면 흐름 immunoassay 준비. 우리의 결과 우리의 mAb 기반 분석 실험 생물학을 공부 하 고 특히 전통 중국 의약품에 사용 된 천연 제품 파생 된 화합물의 품질에 대 한 편리 하 고 필수적인 도구 나타냅니다.

Protocol

이 연구에서 수행 하는 동물 절차의 모든 중국 의학 (승인 번호 2016BZYYL00109)의 베이징 대학에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다. 참고: 여성 BALB/c 마우스 (8 주 이전) 했다 hapten-운반대 단백질 어원이 같은 말을으로 예방 접종 혼자, 작은 분자를 사용 하는 경우 (< 1000 다) 면역 반응을 유도 수 없습니다. 그러나, 항 원 합성에 캐리어 고분자 작은 분자 변화. 이러한 맥락?…

Representative Results

단일 클로 널 hybridomas의 세대 Hapten-운반대 켤레의 분자량은 MALDI TOF MS 분석에 의해 확인 됐다. BSA와 NAR의 분자량 알려져 있습니다, BSA로 활용 하는 작은 분자의 수를 계산할 수 있습니다. 그림 1 은 NAR BSA22, m/z 77,058에 광범위 한 피크를 표시에 대 한 대표?…

Discussion

여기, 우리 제시 자연 제품에서 파생 된 작은 분자에 대하여 mAbs의 성공적인 생산을 위한 프로토콜. 절차의 필수적인 단계를 설명 하 고 우리는 예를 들어 작은 분자도 NAR을 사용 하 여이 프로토콜의 유틸리티 증명 하고있다. 예제에서는 스펙트럼, 반응 분석, 및 icELISA 결과 대표 실험 및 제어 가져온 데이터를이 프로토콜을 사용 하 여 표시 합니다. 예제 이미지는 hybridomas의 연구원 해야 있을 원하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81573573, 81473338, 및 81503344)와 고전 처방 기본 연구 팀 베이징 대학에서 중국 의학의 의해 지원 되었다.

Materials

800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

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Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

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