Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel
Summary
Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações
Abstract
O acúmulo de misfolded proteínas é central para a patologia na doença de Huntington (HD) e muitas outras doenças neurodegenerativas. Especificamente, uma chave característica patológica de HD é o acúmulo aberrante de proteína mutante HTT (mHTT) em complexos de alto peso molecular e corpos de inclusão intracelulares é composto por fragmentos e outras proteínas. Métodos convencionais para mensurar e compreender que as contribuições de várias formas de agregados contendo mHTT incluem microscopia de fluorescência, análise ocidental do Borrão e filtro armadilha de ensaios.
No entanto, a maioria desses métodos é conformação específica e portanto não pode resolver o estado completo de fluxo de proteína mHTT devido à natureza complexa da solubilidade agregada e resolução.
Para a identificação dos agregados do mHTT e várias formas modificadas e complexos, separação e solubilização dos agregados celulares e fragmentos é obrigatória. Aqui nós descrevemos um método para isolar e Visualizar mHTT solúvel, monômeros, oligômeros, fragmentos, e um insolúvel alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT espécies. HMW mHTT faixas com a progressão da doença, corresponde-se com leituras de comportamento do rato e tem sido beneficamente modulada por determinadas intervenções terapêuticas1. Esta abordagem pode ser usada com cérebro de rato, cultura de células e tecidos periféricos, mas pode ser adaptada para outros sistemas modelo ou contextos de doença.
Introduction
O rompimento das redes de controle de qualidade de proteína que certifique-se de dobramento adequado e degradação de proteínas celulares são provável central para a patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e outros “enrolamento de proteínas” distúrbios de2,3. Uma compreensão detalhada dos componentes de rede de proteostasis e suas contribuições para a patologia são, portanto, crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. HD é causada pelo aumento anormal de uma repetição CAG no gene HD, resultando em um estiramento expandido de polyglutamines (polyQ) na proteína de huntingtin (HTT)4. Uma característica patológica constante de patogênese de HD é o enrolamento resultante, acumulação e agregação de HTT em regiões do cérebro e em tecidos periféricos, que tem sido mostrado para interferir de várias maneiras com a função e a homeostase celular normal 5 , 6. enquanto HTT é expressado ubiquitously, médios neurônios espinhosos o striatum são seletivamente vulneráveis e mais abertamente afetada com notável atrofia cortical também associada à patogênese de HD.
A formação de agregados de HTT no cérebro de doentes de Huntington e modelos animais normalmente tem servido como um marcador de proxy para progressão da doença e ganho negativo dominante da função para o mHTT7. Embora os mecanismos precisos pelos quais proteínas enrolamento e agregação podem contribuir para toxicidade induzida pelo mHTT permanecem pouco claras, a formação destas inclusões no cérebro de doentes de Huntington e vários modelos animais é uma característica invariável e inevitável. Inclusões de aparecem ser composto em grande parte acumulada HTT fragmentos contendo o N-terminal expandido polyQ, indicando que a proteólise e processamento de longa-metragem HTT bem como alternativa de emenda8,9 pode desempenhar um importante papel na patogênese da HD. N-terminal HTT fragmentos pode constituir uma forma patológica de HTT que pode agregar rapidamente, nucleada e acelerar ou propagar a agregação processo10.
No entanto, a presença destas inclusões não necessariamente se correlaciona com toxicidade induzida por HTT ou célula morte11. HTT tem sido proposto para se submeter a um processo de agregação de um monômero solúvel através da espécie oligoméricas solúvel e fibrilas de β-folha para agregados insolúveis e inclusões12. Resolver essas várias espécies de proteína através de ensaios bioquímicos padrão tem sido um desafio no campo, devido a sua estabilidade em baixo-detergente do lysis e dificuldade em Visualizar usando padrão ensaios bioquímicos. Assim, considerações metodológicas são fundamentais para detectar o grau e o padrão do mHTT acumulada e agregado.
O protocolo apresentado aqui fornece um método para visualizar vários intermediários de HTT, especificamente a formação de uma espécie de HMW HTT insolúvel que aparece acompanhar de perto com HD patogênese e doença progressão1,13 ,14. Ser capaz de resolver e controlar múltiplas espécies de mHTT fornece pesquisadores uma ferramenta bioquímica para estudar a patogênese da doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais através da sua modulação e impacto na patogênese da doença.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algumas precauções são necessárias para os protocolos acima garantir resultados consistentes e quantitativos. Primeiro, mHTT em ambas as fracções espontaneamente irá formar agregados ao longo do tempo, após vários ciclos de descongelamento de congelamento, particularmente quando em alta concentração. Assim, é fundamental para congelar alíquotas das preparações de proteína e descongelar somente o volume necessário antes de executar o ensaio conforme descrito no protocolo acima. Além disso, se fração in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH (RO1-NS090390). Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Joan Steffanfor assistência técnica e discussão durante o desenvolvimento deste teste.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
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