JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

Оптимизации генетическим включение химического зондов в GPCR для фото сшивки картирования и Bioorthogonal химии в живых клетках млекопитающих

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Легковесные флуоресценции пробирного представлен для оценки эффективности амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар включению белков в клетках млекопитающих неканонических амино кислот (ncAAs). Описывается применение ncAAs учиться G-протеин рецепторов (GPCR), включая фото сшивки отображение привязки сайтов и bioorthogonal GPCR маркировки на живые клетки.

Abstract

Генетическая включение неканонических аминокислот (ncAAs) через желтый остановка кодон подавления является мощный метод для установки искусственных зондов и реактивной постановление на белки непосредственно в живой клетке. Каждый ncAA включены выделенный ортогональных подавитель tRNA/амино ацил ТРНК синтетазы (ОРСЕ) пару, которая импортируется в организме хозяина. Включение эффективность различных ncAAs может значительно отличаются и неудовлетворительным в некоторых случаях. Ортогональные пар может быть улучшена путем манипулирования ОРСЕ или тРНК. Однако направленной эволюции tRNA или ОРСЕ, использование больших библиотек и методы выбора мертвых/жив не осуществимо в mammalian клетках. Здесь представлен поверхностным и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар в mammalian клетках. Assay позволяет скрининг десятков до сотен вариантов ОРСЕ/tRNA с умеренным усилием и в разумные сроки. Использование этого анализа для создания новых tRNAs, которые значительно улучшают эффективность системы ортогональных Пирролизин описан, наряду с применением ncAAs к изучению G-белка в сочетании рецепторов (GPCR), которые являются сложными объектами для ncAA мутагенез. Во-первых путем систематического включения фото сшивки ncAA по всей поверхности внеклеточного рецептора, сайтов связывания различных лигандов на нетронутыми рецептор сопоставляются непосредственно в живой клетке. Во-вторых, путем включения последнего поколения ncAAs в GPCR, сверхскоростной катализатор свободных рецепторов маркировки с флуоресцентной краской свидетельствует, который эксплуатирует bioorthogonal штамма повышен обратная Дильс ольха циклоприсоединения (SPIEDAC) на живую клетку. Как ncAAs правило может применяться к любой белок, независимо от его размера, метод имеет общий интерес для ряда приложений. Кроме того ncAA включение не требует никакого специального оборудования и легко выполняется в лабораториях стандартных биохимии.

Introduction

Генетических включение химических зондов в белки это мощный метод для содействия расследованию структурных и динамических аспектов белков функции непосредственно в собственном контексте живой клетки. В настоящее время сотни неканонических аминокислот (ncAAs) оснащены наиболее разрозненные химических групп могут быть site-specifically включены в белки биосинтез1,2,3,4. Между ними, один находит Фото чувствительных ncAAs такие фото сшиватели5, Фото клетке6,,78,9 и фото переключаемый аминокислоты10, 11, аминокислоты, учитывая напряженные алкенов и алкинам бесплатно катализатор bioorthogonal химии2,12,13,14,15,16 ,17, аминокислоты, перевозящих Дансил18, кумарина9,19и21 флуорофоров продан20,и аминокислот с другими биофизических зонды как Ну как с поста поступательные изменения1,2,3,4,,2223,24,25.

Генетического кодирования ncAA включена на выделенный амино ацил тРНК синтетаза (ОРСЕ) паре родственных подавитель тРНК, который включает ncAA в ответ янтаря стоп-кодон во время регулярных рибосомных синтеза. ncAARS/tRNA пар спроектированы таким образом, чтобы быть ортогональные в организме хозяина, т.е. не кросс разговор с эндогенного парами. Методика является хорошо установленным в прокариот и эукариот хостов и легко применимые к mammalian клеток. Пар для включения ncAA в mammalian клетках основываются на трех основных систем ортогональных: тирозил системы, которая объединяет TyrRS E. coli26 с супрессор тирозил янтаря с б. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstЯм пара),18,6, E. coli лейцил системы (Ecих/tRNAлеиCUA пара)28 и архей pyrrolysyl системы (PylRS/тРНК Пыль пара)3, whereby tRNAпыль природного янтаря супрессор. В общем каждый ncAA признается специализированных ncAARS. В зависимости от структуры ncAA ncAARS получается через направленной эволюции TyrRS, их или PylRS, хотя некоторые синтетаз может принимать более одного ncAA.

Ортогональные пара импортируется в клетки, просто используя вектор плазмиды. Наиболее распространенных и эффективных плазмид являются bicistronic и кодирования для синтетаза и тРНК, образуя ортогональных пара29. Второй плазмида кодировки для белка процентные янтаря кодон на сайте, предназначенные для модификации совместно transfected. NcAA просто добавляется к среднего роста клеток. Однако различные специализированные группы часто используют различные варианты конструкций плазмида даже для включения же ncAA. Конструкции отличаются расположения генов в вектор, тип синтетаза, использование кодон в синтетаза гена, Чистая Промоутер, вариант тРНК и количество кассет выражений тРНКГлу. Кроме того включение эффективность различных ncAAs могут сильно варьироваться из-за различных каталитической эффективности различных синтетаз, качество tRNA и другие факторы30. Таким образом важно иметь под рукой быстрый и надежный метод для оценки эффективности ортогональных пары, как выбрать наиболее подходящую систему для нужного приложения, так и для выполнения некоторых шагов оптимизации, которые улучшают общее выражение протеина урожайность.

Мы создали простой и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар29 (рис. 1). В assay клетки совместно transfected с кодировкой плазмиду для ортогональных пары, вместе с bicistronic репортер плазмида кодирования для зеленого флуоресцентного белка, принимая янтаря стоп-кодон в либеральной позиции (тегEGFP) и mCherry ген. Красный и зеленый флуоресценции целом-lysates клетки считываются в отдельных каналов на пластины читателя в 96-луночных пластине. Интенсивность флуоресценции зеленый напрямую коррелирует с эффективности работы автожелтого подавления, тогда как интенсивность флуоресценции Красного дает прямую оценку размера измеряемых образца и эффективность трансфекции. В отношении подобных анализов на основе флуоресценции вспомогательной ячейки, сортируя (FACS) зачитывает31,32, assay дает немедленное и всеобъемлющей оценки экспрессии белков клеточных населения, которая больше Представитель обычно экспериментальных условиях и предлагает упростить сбор и обработка данных со стандартным программным обеспечением. В целом основным преимуществом assay является, что от среднего до большого числа проб могут быть проанализированы параллельно. Используя этот assay, мы экранированный рационально разработан библиотека подавитель tRNAs для повышения эффективности Pyl ортогональные системы30. Эта работа описывает экспериментальный протокол для выполнения этот assay и показать примеры его применения, включая оптимизацию ортогональных пары для включения фото сшивки ncAA p-azido-L-фенилаланин (Ази) и сравнение Включение эффективность различных аминокислот (рис. 2).

За последние годы ncAA инструменты доказали очень мощный для изучения структурных и функциональных аспектов G-белка в сочетании рецепторов (GPCR)33,34,35,,3637 , 38. в организме человека, GPCR образуют большой семьи мембранных рецепторов (800 членов) и представляют собой главных мишеней для лекарственных средств. Прямые структурных характеристик GPCR еще сложной и весьма взаимодополняющими биохимические методы необходимы для их расследования. Мы первыми начали использовать Фото сшивки ncAAs карта GPCR поверхностей и обнаружить лигандом привязки карманы34. Используя наши оптимизированные системы для включения Ази, мы систематически учитываются Azi на протяжении всей juxtamembrane области GPCR непосредственно в живых клетках млекопитающих. После УФ-облучения Ази образует Высокореактивная nitrene видов, которые ковалентно захватывает соседних молекул. Когда лигандом добавляется к системе, Ази служит близость зонд выявить, какие позиции рецептора близко связанных лигандов. Таким образом режим привязки гормон нейропептида Urocortin I (Ucn1) на класс B GPCR АКТГ выпуская фактор рецептор типа 1 (CRF1R)33 был впервые открыт. В последнее время мы раскрыли собственный привязки шаблонов агонисты и антагонисты на же рецептора38. Аналогичный подход применяется другими раскрыть orthosteric и аллостерический привязки сайтов других пептидов и малых молекул лигандов на других GPCR39,40,,4142. Эта рукопись описывает экспериментальный протокол, применяется в нашей лаборатории для фото сшивки сопоставления GPCR поверхностей. Метод относительно быстро, просто и не требует никакого специального оборудования, так что это применимо в лабораториях стандартных биохимии. Важно отметить, что этот подход обеспечивает ценный инструмент не только для идентификации сайтов связывания лиганд, где 3D структурных данных не хватает, но и дополнить существующие в vitro данные с информацией от полностью post-translationally модифицированных рецепторов в физиологической среды живой клетки.

Недавнее развитие Роман ncAAs подшипника на стороне цепочки химических групп подходит для сверхбыстрой бесплатно катализатор bioorthogonal химии открыло возможность установки последнего поколения флуорофоров для супер-резолюции изображений в белки непосредственно на живой клетки2,43. Такие химические анкеры включают напряженными cyclooctyne в SCOK14, nonyne бицикло [6.1.0] в BCNK12,17и транс cyclooctenes в ТШО * K13,15,17 среди других ncAAs укрывательство норборненом16,17,44 или cyclopropene45,группу в составе46 . Громоздкие ncAAs bioorthogonal химии, включаются в вариант PylRS, обычно обозначается как PylRSAF (указанием мутации Y271A и Y349F в . м. barkeri PylRS), а также других специальных развивались ncAARSs17 , 44. анкер bioorthogonal реагируют с тетразина реагенты47 через обратные электрон спрос Дильса-Альдера циклоприсоединения давать высокие урожаи маркировки в течение нескольких минут43,48. Однако применение этого мощного подхода к этикетке GPCR была сложной из-за низкой общей эффективности системы ортогональных ncAA включение. С помощью нашей усовершенствованной системы пыль, мы недавно продемонстрировали высокодоходные включение таких аминокислот в GPCR и сверхскоростной GPCR маркировки на поверхности живой клетки млекопитающих30. Приклеенные этикетку рецепторы были до сих пор функциональна, как они физиологически внутреннюю активировав с агонистом рецепторов. Экспериментальный протокол для включения bioorthogonal якоря в GPCR и следующие маркировки шаги описаны здесь. Оснащение GPCR небольшие яркие флуорофоров является первый основной шаг к изучению GPCR структурной динамики в живой клетке через микроскопии передовых методов.

Protocol

1. на основе флуоресценции скрининг эффективности включения (рис. 1) Сохранить HEK293 клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM; высокие глюкоза, 4 мм глутамина, пируват) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажно?…

Representative Results

Наброски флуоресценции assay изображен на рисунке 1. В трех приложениях используется assay. В первую очередь проверяются несколько вариантов tRNA для включения Lys(Boc) пыль ортогональных парой. Lys(Boc) это аминокислота труднодоступных похож на пыль. Как пыль не яв?…

Discussion

Протокол описывает простой и надежный анализа для оценки эффективности ортогональных пар для включения ncAAs в белки, выраженные в mammalian клетках. Главное преимущество этого метода в отношении широко используемых анализов на основе СУИМ является, что она позволяет одновременной подготов…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была основана на Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под гранты CO822/2-1 (Эмми Нётер программы) и CO822/3-1-I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. 生物化学. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. 化学. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image