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免疫与感染

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/57061
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program,University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences,University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Abstract

Modificaciones post-traduccionales que ocurren en las posiciones específicas de proteínas han demostrado desempeñar un papel importante en una variedad de procesos celulares. Entre ellos, la acetilación reversible de la lisina es uno de los más ampliamente distribuidos en todos los ámbitos de la vida. Aunque se han realizado numerosos estudios de acetylome basada en espectrometría de masa, más caracterización de estos objetivos de acetilación putativo ha sido limitada. Una razón posible es que es difícil generar proteínas puramente acetiladas en posiciones deseadas por mayoría enfoques bioquímicos clásicos. Para superar este reto, se ha aplicado la técnica de expansión del código genético para utilizar el par de una variante de ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa y su cognado tRNA de las especies de Methanosarcinaceae , para dirigir la incorporación cotranslacional de acetyllysine en el sitio específico en la proteína de interés. Después de la primera aplicación en el estudio de la acetilación de histonas, este enfoque ha facilitado estudios de acetilación sobre una variedad de proteínas. En este trabajo, hemos demostrado un protocolo fácil para producir proteínas site-specifically acetiladas utilizando la bacteria Escherichia coli de la modelo como anfitrión. Malato deshidrogenasa fue utilizada como un ejemplo de demostración en este trabajo.

Introduction

(PTMs) las modificaciones post-traduccionales de las proteínas ocurren después del proceso de traducción y surgen de adición covalente de grupos funcionales a los residuos del aminoácido, jugando papeles importantes en casi todos los procesos biológicos, incluyendo gene transcripción, respuesta al estrés, diferenciación celular y metabolismo1,2,3. Hasta la fecha, cerca de 400 distintivo PTMs han sido identificados4. La complejidad del genoma y el proteoma se amplifica en gran medida por la proteína MPa, regular localización y actividad de la proteína, y afectan la interacción con otras moléculas como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y cofactores5.

Acetilación de proteínas ha estado a la vanguardia de los estudios de MPa en las última dos décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilación de la lisina fue descubierta en las histonas hace más de 50 años13,14, ha sido bien analizado y se sabe para existir en más de 80 factores de transcripción, reguladores y varias proteínas15, 16,17. Estudios sobre la acetilación de proteínas no sólo nos proporciona una comprensión más profunda de sus mecanismos reguladores, sino también guiada por tratamientos para un número de enfermedades causadas por acetilación disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. se creía que la acetilación de la lisina ocurre solo en eucariotas, pero estudios recientes han demostrado que la acetilación de proteínas también juega un papel clave en la fisiología bacteriana, incluyendo chemotaxis, resistencia ácida, la activación y estabilización de Islas de patogenicidad y virulencia otra relacionadas con las proteínas24,25,26,27,28,29.

Un método comúnmente utilizado para caracterizar bioquímicamente la acetilación de la lisina está utilizando mutagénesis sitio-dirigida. Glutamina es utilizada como un imitador de acetyllysine debido a su tamaño y polaridad similar. Arginina es utilizada como un imitador de lisina no acetilado, ya que conserva su carga positiva en condiciones fisiológicas pero no puede ser acetilado. Sin embargo, ambos imitadores no son isosteres reales y no siempre producen los resultados esperados30. El enfoque más riguroso es generar homogéneo acetiladas proteínas en residuos de lisina específico, que es difícil o imposible por métodos más clásicos debido a la baja estequiometría de acetilación de la lisina en naturaleza7,11. Este desafío ha sido desentrañando la estrategia de expansión del código genético, que emplea una ingeniería pyrrolysyl-tRNA sintetasa variante de especies Methanosarcinaceae para cargar tRNAPyl con acetyllysine, utiliza el host traslacional maquinaria para suprimir la UAG stop codon en el mRNA y dirige la incorporación de acetyllysine en la posición diseñada de la proteína blanco del31. Recientemente, hemos optimizado este sistema con una mejor EF-Tu-Unión tRNA32 y un actualizado acetyllysyl-tRNA sintetasa33. Además, hemos aplicado este sistema mayor incorporación en estudios de acetilación de la malato deshidrogenasa34 y Tirosil tRNA sintetasa35. Aquí, demostramos el protocolo para la generación de proteínas puramente acetiladas de la clonación molecular para identificación bioquímica mediante el uso de malato deshidrogenasa (MDH), que hemos estudiado como ejemplo demostrativo.

Protocol

1. dirigida mutagénesis Gene de la blanco Nota: MDH se expresa bajo el promotor de T7 en el vector de pCDF-1 con el origen de CloDF13 y un número de copia de 20 a 4034. Introducir el codón ámbar en la posición 140 en el gene de cartillas (adelante cartilla: GGTGTTTATGACetiquetaAACAAACTGTTCGGCG y revertir la cartilla: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), siguiendo las instrucciones del kit de mutagénesis sitio-dirigida….

Representative Results

El rendimiento de proteína MDH acetilado fue 15 mg por cultura de 1 L, mientras que la de tipo salvaje MDH fue 31 mg por cultura de 1 L. Proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1. El MDH de tipo salvaje fue utilizado como un control positivo de34. La proteína purificada de células que el sistema de incorporación de acetyllysine (AcK) y el gen mutante mdh , pero sin confirmación …

Discussion

La incorporación genética de noncanonical aminoácidos (ncAAs) se basa en la supresión de un codón asignado, sobre todo el ámbar stop codón UAG36,37,38,39, por el tRNA cargado de ncAA que contiene el anticodon correspondiente. Como es sabido, el codón UAG es reconocido por el factor de liberación-1 (RF1) en bacterias y puede también ser suprimido por cerca de tRNAs cognado de anfitrion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los NIH (AI119813), la puesta en marcha de la Universidad de Arkansas y el premio del Instituto de biociencias de Arkansas.

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking
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Site-specific AcetylationProtein AcetylationGenetic Code ExpansionPyrrolysyl-tRNA SynthetaseAmber Stop CodonE. Coli ExpressionSite-directed MutagenesisAcetyllysine Incorporation

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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).
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