بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) من البروتينات التي تحدث بعد عملية الترجمة، وتنشأ عن إضافة المجموعات الوظيفية التساهمية لمخلفات الأحماض الأمينية، تضطلع بأدوار هامة في تقريبا جميع العمليات البيولوجية، بما في ذلك الجينات النسخ واستجابة الإجهاد والتمايز الخلوي والتمثيل الغذائي^1،،من²³. وحتى الآن، حوالي 400 مميزة قد بتمس المحددة⁴. المعضلة من الجينوم والبروتين يتم تضخيمه إلى حد كبير من قبل بتمس البروتين، كما أنها تنظم نشاط البروتين والتعريب، وتؤثر على التفاعل مع جزيئات أخرى مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون والعوامل المساعدة⁵.

وقد أسيتيليشن البروتين في طليعة الدراسات بتمس في آخر عقدين^6،،من^{78،9،10،11،12}. أسيتيليشن يسين كان أول من اكتشف في هيستونيس منذ أكثر من 50 عاماً^13،14، قد تم التدقيق جيدا، ومن المعروف أن توجد في أكثر من 80 من عوامل النسخ، والمنظمين، ومختلف البروتينات^{15، ،}من ¹⁶¹⁷. دراسات في أسيتيليشن البروتين قد وفر لنا فهما أعمق لآلياتها التنظيمية، بل يسترشد أيضا علاجات لعدد من الأمراض الناجمة عن اختلال أسيتيليشن^{18،19، 20 , 21 , 22 , 23}-وكان يعتقد أن acetylation يسين يحدث فقط في حقيقيات النوى، ولكن الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن acetylation البروتين كما تلعب أدواراً رئيسية في فسيولوجيا البكتيريا، بما في ذلك إنزيمية ومقاومة الأحماض والتنشيط وتحقيق الاستقرار في جزر الإمراضية وضراوة الأخرى المتعلقة بالبروتينات^24،25،،من^2627،،من²⁸²⁹.

باستخدام طريقة شائعة المتحلل تميز acetylation يسين الطفرات الموجهة من الموقع. الجلوتامين كتقليد أسيتيليسيني بسبب حجمها وقطبية مماثلة. ويستخدم ارجينين كتقليد يسين غير أسيتيلاتيد، نظراً لأنه يحتفظ تهمة إيجابية في ظل الظروف الفسيولوجية ولكن لا يمكن أن يكون أسيتيلاتيد. ومع ذلك، كلا يقلد ليست إيسوستيريس حقيقية ولا تسفر دائماً عن النتائج المتوقعة³⁰. النهج الأكثر صرامة لتوليد بروتينات أسيتيلاتيد البلوتينيوم في المخلفات يسين محددة، التي من الصعب أو المستحيل على الأساليب الأكثر كلاسيكية بسبب ستويتشيوميتري منخفض من acetylation يسين في الطبيعة^7،11. وقد تم متدهور هذا التحدي في استراتيجية التوسع في الشفرة الجينية، التي توظف هندسة بيروليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز البديل من الأنواع ميثانوسارسيناسيي لشحن الحمض الريبي النووي النقال^{برونتوسوروس} مع أسيتيليسيني، يستخدم المضيف الآلات متعدية لقمع الفريق الاستشاري وقف كودون في مرناً، ويوجه إدماج أسيتيليسيني في موقف مصممة ل البروتين المستهدف³¹. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل هذا النظام مع الإنكليزية والفرنسية-تو-ملزمة الحمض الريبي النووي النقال تحسين³² ورفع مستوى أسيتيليسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز³³. وعلاوة على ذلك، نحن طبقت هذا النظام إدماج تعزيز الدراسات acetylation مالات نازعة³⁴ وتيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز³⁵. هنا، علينا أن نظهر البروتوكول من أجل توليد بروتينات أسيتيلاتيد بحتة من الاستنساخ الجزيئي لتحديد الهوية الكيميائية الحيوية باستخدام نازعة مالات (MDH)، الذي درسناه على نطاق واسع كمثال تتضح.