基于复用等温放大诊断平台检测 Zika、基孔肯亚和登革热1

蚊虫传播的病毒感染, 包括登革热、基孔肯亚和 Zika 病毒正在上升, 需要立即管理战略。登革热和基孔肯亚病毒已经在许多热带地区流行, 在那里 Zika 现在在西半球传播¹。Zika 病毒, 如登革热, 是Flaviviridae家族的成员, 原产于非洲, 有一个亚洲和两个非洲遗传血统²。尽管 Zika 病毒的鉴定可以追溯到 1947, 但在太平洋和美洲出现前半个世纪, 人类的 Zika 感染仍然是零星的。第一次报告说, 2007年在密克罗尼西亚联邦发生的 Zika 热爆发, 随后是在2013年和2014法属波利尼西亚。美洲第一次大规模暴发发生在2015年巴西。

Zika、基孔肯亚和登革热病毒主要由伊蚊蚊和白纹伊蚊传播。然而, Zika 有额外的下游人到人传输的可能性, 可能通过性接触传播, 母婴互动, 并通过母乳喂养^3,4,5。Zika 发烧最初被认为只导致轻度疾病。然而, 它后来与成人的格林-巴利综合征, 新生儿小头和慢性肌肉骨骼疾病, 可能持续数月至数年。诊断 Zika 疾病可能是挑战, 因为 Zika 感染的症状类似于其他蚊子传播病毒⁶。这些病毒的常见联合感染使鉴别诊断更加具有挑战性^7,8。因此, 需要对 Zika 和其他病毒的核酸进行快速、可靠的检测, 以便实时了解流行病学, 启动控制和预防措施, 并管理病人护理⁹。

目前对这些病毒的诊断测试包括血清学测试、病毒分离、病毒测序和反向转录 pcr (rt-pcr)。标准血清学方法往往受到不充分的敏感性, 结果可能是复杂的交叉反应的病人谁曾感染其他 flaviviruses。

因此, 核酸检测仍然是检测和鉴别这些病毒最可靠的方法。Zika 和其他蚊虫传播病毒的检测通常是使用 rt-pcr 或实时 rt-pcr 在各种生物液中进行, 如血清、尿液、唾液、精子、母乳和脑液^10,11。尿液和唾液样本通常比血液更可取, 因为它们的 PCR 抑制较少, 病毒负载更高, 病毒存在时间较长, 而且收集和处理的易用性提高了^12,13。然而, 基于 RT PCR 的诊断测试包括大量的样品准备步骤和昂贵的热循环设备, 使其对护理点的优化不那么理想。

反向转录环介导的等温放大 (rt 灯) 已成为一个强大的 rt-pcr 替代方案, 由于其高灵敏度和特异性¹⁴, 它对生物样品中的抑制物质的容忍¹⁵, 和单一温度下的操作, 大大降低了检测的复杂性和相关成本, 使之适合低资源环境。RT 灯, 因为它是经典的实施, 包括六引物, 绑定到八个不同的区域内的目标 RNA。它运行在恒定的温度在60°c 和70°c 之间, 并且使用一条反向逆转录酶和一根有强的链置换活动的脱氧核糖核酸 pcr。

在 RT 灯的初始阶段, 向前和向后内部引物 (FIP 和保险,图 1A) 连同外向前和向后引物 (F3 和 B3) 形成哑铃结构, 种子结构的指数灯放大。放大是进一步加速的循环向前和向后引物 (LF 和磅), 这是设计来绑定的单一搁浅地区的哑铃, 并导致形成 concatemers 与多个重复循环¹⁶。基于浊度或锂染料读数的经典光源检测方法并不完全适合 Zika 的点检, 在那里需要某种程度的多路复用^17,18,19。在这些系统中, 多路复用不容易获得, 因为由于目标放大, 它们容易产生误报。

为了管理这些问题, 文献以 “线置换探针” 的形式向经典的 RT 灯体系结构^20、21、22添加了一个附加组件。每个探针都有一个序列特定的双链区域和一个单链启动区域。该探针与单绞区被标记为 5 ‘-荧光, 互补探针是修改与 3 ‘-端淬火。在没有目标的情况下, 由于互补探针链的杂交, 没有发现荧光, 从而使荧光和淬火接近。在目标存在的情况下, 荧光探针的单链部分与靶上的补体相结合, 然后通过链置换聚合酶进行扩展。进一步的聚合酶引伸反向引物导致分离的淬火链从其互补荧光标记链, 允许发射荧光(图 1B)。通过这种设计, 在哑铃形成后产生信号, 减少了假阳性信号的几率。

链置换探针的双绞线可以是任意序列, 当应用多路复用时, 相同的序列可以与不同的荧光-淬火对一起使用。通过这种体系结构, 直接将病毒污染的尿液、血清或蚊子样本压扁在纸上, 而不进行样品制备。在 30-45 分钟内产生肉眼可见的三色荧光读出, 并使用蓝色 LED 和橙色过滤器在3维打印的观察框中可视化信号。冷冻干燥的 RT 灯试剂启用此工具包的部署, 以降低资源设置, 不需要制冷。