JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
发育生物学

Vasculogenesis Kinetik analizi Vasculogenesis ve anjiogenezi Vitro dinamiklerini Quantifies

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/57044
, , ,
1Department of Cellular and Integrative Physiology,Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research,Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy,Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine,Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics,Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology,Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center,Indiana University School of Medicine

Summary

Burada, biz bir protokol zaman hata görüntüleme için mevcut ve in vitro vasculogenesis kullanarak analiz faz kontrast mikroskobu açık kaynak yazılım, Vasculogenesis Kinetik analizi ile birleştiğinde. Bu iletişim kuralı kantitatif çok sayıda hücre tipleri veya damar hastalığı model deneysel koşullar vasculogenic potansiyelini değerlendirmek için uygulanabilir.

Abstract

Vasculogenesis hangi tarafından endotel kök ve progenitör hücreler de novo damar oluşumu geçmesi karmaşık bir süreçtir. Vasculogenesis kantitatif değerlendirilmesi endotelyal progenitor hücre işlevselliği merkezi bir okuma oldu ve bu nedenle, çeşitli girişimlerde vitro ve in vivo vasculogenesis modelleri geliştirmek için yapılmıştır. Ancak, standart yöntemleri kapsamında, bu son derece dinamik bir süreç, bir çok yönünü yakalamak başarısız statik ölçümleri ile sınırlıdır. Bu nedenle, ağ oluşumu ve sabitleme oranları quantitate hem potansiyel mekanizmaları vasküler temel bir anlayış sağlamak amacıyla vitro vasculogenesis Kinetik değerlendirmek için bu yeni iletişim kuralı geliştirme hedefi oldu disfonksiyon. Bu iletişim kuralının uygulanması maternal diabetes mellitus için maruz hücre (ECFCs) şekillendirme fetal endotel koloni kullanarak gösterilmiştir. Fetal ECFCs, kültürlü ve slaytları nerede vasculogenesis uygulandı membran matris içeren kaplama doğum takip göbek kordon kanı elde. Görüntüleri tüm slayta Wells hızlandırılmış faz kontrast mikroskobu 15 saatin üzerinde kullanarak elde. Görüntüleri Nicel veri Kinetik analizi, Vasculogenesis (KAV) adı verilen bir analiz yazılımı kullanarak türetme için analiz edildi. KAV yığında çok zaman noktası faz kontrast görüntü ağ yapısı dahil olmak üzere on parametreleri (9 ölçülür, hesaplanan 1) türetmek için ağ bileşenlerini analiz için görüntü segmentasyonu iskeletleşmiş tarafından takip kullanır: kapalı ağları, ağ alanlarında, düğümler, dalları, toplam şube uzunluk, ortalama branş uzunluğu, üçlü dallı düğümleri, dört dallı düğümleri, ağ yapıları ve şube düğüm oranı. Uygulama tespit bu protokol Gebelik Diyabet tarafından karmaşık elde ECFCs vasculogenesis oranda değişmiş. Ancak, bu teknik rapor burada kapsamı dışındadır geniş etkileri vardır. Bu yaklaşım uygulanması mekanik değerlendirme geliştirmek ve fonksiyonel sonuçlar vasculogenesis ve çok sayıda hücre tipleri veya hastalık durumlarında biyolojik açıdan önemli diğer dallanma süreçleri iyileştirmek.

Introduction

Vasculogenesis veya de novo damar oluşumu, geçmesi endotelyal progenitor hücreler yeteneğini geliştirme1sırasında embriyonik damarlara oluşturmada önemlidir. Ayrıca, daha fazla gemi oluşumu ve anjiogenezi bilinen, önceden var olan gemiler, olgunlaşma Ayrıca bir süreçtir anahtar geliştirme ve postnatal hayatta kan akımı ve vücut2boyunca homeostazı korumak için. Bütün organları vücudun damar sistemi’dır oksijen ve besin ve atık3kaldırılması için bağlıdır. Öyle ki damar oluşumu ve onarım yetersiz ya da aşırı vasküler Homeostazı, tutulmayan, vasküler hastalıklar4neden olabilir. Onlar organ sağlık bakım gerekli olan ve çok sayıda patolojik devletler gelişiminde karıştığı bu nedenle, damar oluşumu ve adaptasyon sık, incelenmektedir.

Damar sistemi geliştirme yanı sıra hastalığı tezahürü ve ilerleme katılımı artan bir anlayış nedeniyle deneyleri modeli vasculogenesis ve anjiogenezi içinde in vitro ve in vivo5 için geliştirilmiştir ,6,7. Damar oluşumu modelleme endotel hücrelerinde hücre organizasyon ve damar ağları8,9,10oluşumu teşvik membran matris gibi vasküler hücrelerin kaplama içerir. Genellikle, aşağıdaki kuluçka, hücre ağlar görüntüleri analiz11,12,13az sayıda sonuçlanan bir zaman noktasında yakalanan görüntüleri gece. Bu nedenle, analitik yaklaşımlar büyük ölçüde geliştirilmiş ve tek zaman noktası Değerlendirmeler10,14için en iyi duruma getirilmiş. Ancak, statik analizler damar oluşumu dinamik bir süreç yakalama sade bir şekilde yetersiz ve potansiyel mekanizmaları dahil sınırlı içgörü sağlamak. Görüntüleme sıklığı artan büyük olasılıkla oluşumu Kinetik tanımlamak için gerekli verileri sağlamak ancak düşsel yaklaşımı çok zaman bir noktaya daha önce gelişmiş Analytics uygulama verimsiz ve emek yoğun14olurdu. Ayrıca, piyasada bulunan analizleri gelişimi rağmen görüntü başına ödeme ücreti bu seçeneği maliyet-engelleyici Kinetik çalışmalar görüntüleri binlerce oluşturulan15olduğu için işler. Bu nedenle, yakalama ve vasculogenesis vitrohızlandırılmış canlı cep mikroskobu tarafından oluşturulan büyük görüntü kümeleri çözümleme olanağı dahil, ölçmek akıcı ve etkili bir yaklaşım alanında ihtiyaç vardır.

Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için yeni bir yaklaşım her 15 dk.16vasculogenesis görüntüleri ile dinamik değerlendirilmesi etkinleştirmek için görüntüleme elde zaman noktası genişletme amacı ile geliştirilmiştir. Birkaç saat içinde birden çok zaman Puan yakalayarak, bu yaklaşım vasculogenesis yanı sıra potansiyel mekanizmaları oluşumu ve bakım damar ağları için katkıda bulunan bir anlayış süreci daha ayrıntılı bir tasviri sağlar. Frekans ve resim alma kalitesini geliştirmeye ek olarak, bu yaklaşım bir açık kaynak eklentisi17şeklinde roman yazılım içerir. Kinetik analizi, Vasculogenesis (KAV olarak), başvurulan yazılım, görüntü işleme ve analiz için özellikle çok zaman noktası alımlar oluşturulan büyük görüntü kümesi birleştirmek aerodinamik bir uygulamadır. KAV faz kontrast görüntü segmentasyonu iskeletleşmiş18tarafından takip resimlerle analiz eder. Ağ yapısının on parametreleri KAV tarafından sayısal dahil: dalları, kapalı ağlar, düğümleri, ağ alanlarında, ağ yapıları, üçlü dallı düğümleri, dört dallı düğümleri, toplam şube uzunluğu, ortalama branş uzunluğu ve düğüm oranı (bkz: Şube şekil 1‘ deki şematik)16. Uygulama KAV yaklaşımın bir roman, hesaplanmış fenotip in vitro vasculogenesis, şube düğüm oranı olarak anılacaktır içerir. Son çalışmalarımız bu oran ağ bağlantısı göstergesidir ve diğer hücresel süreçler hareketliliği16gibi ağ oluşumu dahil ile iliskili olabilir gösterdi.

Fetal endotel koloni oluşturan hücre (ECFC) vasculogenesis bu çalışmalarda değerlendirildi rağmen bu görüntü toplama ve analizi yaklaşımı kolayca vasculogenesis ya da angiogenez tabi herhangi bir hücre tipleri değerlendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşım bu çalışmalarda gösterildiği gibi Gestasyonel diyabet mellitus, patolojik durumları çeşitli kaynaklanan değişmiş vasküler işlevini tanımlamak için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem diğer biyolojik ilgili işlemler için önemli olan ağ oluşumu ve dallanma, değerlendirmek için adapte. Böylece, bu yeni yaklaşımın benzersiz biyolojik sistemlere uygulanması olası etkisi henüz tespit olmaktır.

Protocol

1. hazırlıkları Kültür endotel koloni oluşturan hücreler (ECFCs)Not: Fetal ECFC örnekleri bu deneylerde kullanılan insan göbek kordon kanı izole ve Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi olarak yukarıda açıklanan6, Anjiyo BioCore (ABC) tarafından kültürlü. Rutin kalite kontrol fenotipleme endotel antijenleri ifadesi yukarıda açıklanan19,20,21olarak onaylamak için ABC içinde yapılmıştır. Deneylerde kullanılan örnekleri pasajlı en az (2 – 3 kez). Tüm doku kültürü iş bir doku kültürü mahallede gerçekleştirildi. Doku kültürü plakaları ve çözümleri, dahil olmak üzere tüm reaktifler steril edildi. İki gün önce deneme, 100 mm ile 6 mL 0,05 mg/mL tip 1 kollajen doku kültürü plakalar yuvarlak ceket ve 37 ° C’de gecede kuluçkaya.Not: Tip 1 kollajen bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,05 mg/mL 20 nM Asetik asit içeren çift distile suda seyreltilmiş. Gün önce deneme, trypsinize ve ECFCs 1.1.1 türü 1 kolajen kaplı levha üzerinde replate. (Bkz: Not küçük 1.1). ECFCs trypsinize için medya kaplama hücreleri Aspire edin ve PBS 7 mL ile yıkayın. PBS, Aspire edin sonra 2-3 mL % 0.5 tripsin ekleyin ve 2-5 dk 37 ° C’de hücreler kuluçkaya Kuluçka tripsin ile hemen arkasına EGM2 ve damlalıklı yukarı ve aşağı tüm yapışık hücreleri yerinden 3 mL ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarın. 500 x g oda sıcaklığında 5 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve hücre topakları 1-2 mL EGM2 yeniden askıya alma. Hücre süspansiyon iyice karıştırın ve sayımı için küçük bir aliquot (20-40 μL) kaldırın. Eşit parçaya trypan mavi aliquot hücresine ekleyin ve bir hemasitometre üzerine 10 µL pipet. Hemasitometre dört birincil renkleri hücreleri saymak.Not: tüm örnek saymak için hemasitometre her iki tarafında doğruluğu artırmak için kullanın. Adım 1.1.1, iki kez PBS 7 mL ile hazırlanmış doku kültürü kolajen kaplı Tabakları yıka. İkinci PBS yıkama, endotelyal büyüme orta 2 10 mL (EGM2) ekleyin aspirating sonra % 10 fetal sığır serum plakaları ile takıma medya kültür. 1.1.7. adımda elde hücre sayımları kullanarak, plaka 4 x 105 hücrelere gerekli hücre süspansiyon hacmi hesaplama. Plaka 4 x 105 ECFCs doku kültürü plakaları 1.1.8. adımda hazırlanan ve 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) gecede kuluçkaya. Deney öncesinde kaynağı 4 at depolamak °C gece 3 “x 2” metal plaka, slayt (paket hood açıkta kadar tutun), bir kutu steril 20 microliter (μL) ipuçları ve membran matris (matrix) depolar.Not: Matrix uzun süreli depolama için-80 ° C’de tutulur; her zaman bir gecede veya birkaç saat kullanmak için önceden 4 ° C’de erimek. Bilgisayarın sabit sürücülerde-görüntüler için yeterli alan kullanılabilirliğini onaylamak.Not: Bu protokol için özetlenen yapılandırma’yı kullanarak, yaklaşık olarak 60 gigabayt (GB) alan deneyi (4 GB/de) gerekli idi. Ancak, alan tahminler donanım yapılandırmanıza bağlı ve her sistem için belirlenecek gerekir. 2. iletişim kuralı 1: Deneysel Kurulum: Slayt hazırlama Toplamak ve malzemeleri hazırlamak Denemenin, gün için hücreleri bir kova buz, küçük bir kap kuru buz, makas ve 20 μL pipet de dahil olmak üzere slayt üzerinde kaplama malzemeleri toplamak. Tüm öğeleri % 70 etanol ile sprey, kağıt havlu ile kuru silin ve öğeleri bir steril doku kültürü başlık yerleştirin. 4 ° C’de depolanan tüm malzemeleri toplamak (bkz. Adım 1.2) metal plaka, kutu ipuçları, slayt ve matris de dahil olmak üzere. İpuçları kutu % 70 etanol ile sprey ve kutuyu kuru buz kapsayıcısına getirin.Not: Kaldır matris 4 ° C buzdolabı sadece hazır olduğunda kullanmak ve her zaman buz üzerinde matris devam. Metal plaka % 70 etanol ile sprey ve buz kovası buz embed. Slayt içeren paketi açın ve slayt soğuk tutmak için metal tabağa yerleştirin. Yük matris bir slayda Pipet için 10 μL ayarla ve soğuk uç kutusundan pipet ile ucunu kaldırmak. Yaklaşık 1 cm ucu sonu kapalı makasla kesme.Not: kesim dik kabarcıklar matris azaltmak için belgili tanımlık uç. Pipet bir birime ucu içe doğru yapışmasını matris hesaba 10 μL daha biraz daha fazla ayarlanabilir. Yavaş yavaş matrix pipet ucu çizin. Hemen pipet ucu iyi ortasına yerleştirin. Pipet ucu Kuyunun dibine hafifçe dokun ve yavaş yavaş matrisi itmeye.Not: pipet üzerinde bu kadar kabarcıklar forma neden olmaz. Bir balonu formları varsa, hemen küçük bir ipucu kullanarak pop. Slayt 15 bireysel wells içerir. Her şey için önceki adımı yineleyin. Her şey için yeni bir pipet ucu tutarlılığı korumak ve matris içinde belgili tanımlık uç güçlendirilerek azaltmak için kullanın. Slayt matris içeren tüm wells ile yüklendikten sonra ta slayda kapağı itin ve 30-60 dk 37 ° C’de matrix katılaşır kadar kuluçkaya.Not: matris kurumasına izin vermeyin. Küçük hacimli (2-3 mL) PBS 50 mL konik tüp slayt matris kurutma riskini azaltmak için kuluçka yakınındaki kap ekleyin. 3. Protokolü 2: ECFCs matrisin kaplama Yapışık ECFCs doku kültürü plakalar kaldır ve süspansiyon toplamak Doku kültürü önceki gün (bakınız Bölüm 1.1.9) ECFCs içeren levha kaplama elde edilir. EGM2 medya Aspire edin ve yapışık ECFCs kez PBS 7 mL ile yıkayın. PBS Aspire edin, 2-3 mL tripsin ekleyin ve 2-5 dk 37 ° C’de yapışık hücreleri kuluçkaya Kuluçka, hemen arkasına EGM2 ve damlalıklı yukarı ve aşağı tüm yapışık hücreleri yerinden 3 mL ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarın. Tüm dört hücre örnekleri süspansiyon toplanan kadar adımları 3.1.1-3.1.3 kalan üç ECFC örnek için yineleyin. Ana karışımları hazırlamak 500 x g oda sıcaklığında 5 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve hücre topakları 1-2 mL EGM2 yeniden askıya alma. Hücre süspansiyon iyice karıştırın ve sayımı için küçük bir aliquot (20-40 μL) kaldırın. Eşit parçaya trypan mavi aliquot hücresine ekleyin ve bir hemasitometre üzerine 10 μL pipet. Hemasitometre dört birincil renkleri hücreleri saymak.Not: tüm örnek saymak için hemasitometre her iki tarafında doğruluğu artırmak için kullanın. Yukarıdan hücre kullanarak sayar, 1.4×104 hücreleri içeren her hücre örnek hacmi hesaplamak. Tüm hücre süspansiyonları iyice karıştırın ve aliquot 1.4 x 104 hücrelere deneysel her koşul için bir ana karışım hazırlamak için taze bir tüp. Böylece her ana Mix son hacim 175 μL EGM2 medya ekleyin. Slayt üzerindeki bireysel kuyu içine ana karışımı hafifçe pipetting ve aliquot 50 μL tarafından her ana mix karıştırın.Not: tüm örnekleri nüsha 3 kuyuları için yeterli hacim sağlamak 3,5 kuyuları için hesaplanan ana karışımları ile kaplama. Slayt kuluçkaya Görüntüleme için mikroskop odasına taşınabilecek kadar slayt 37 ° C’de kuluçkaya.Not: Kaplama ve görüntüleme arasında zaman veri kaybı vasculogenesis erken evrelerinde sınırlamak olabildiğince kısa olmalıdır. 4. Protokolü 3: Mikroskop kurulum ve resim alma Not: çalışmalarımız için iletişim kuralları 2 ve 3 aynı anda ayrı bireyler tarafından yapılmıştır. İletişim kuralları 2 ve 3 aynı birey tarafından tamamlanması gereken eğer Protokolü 3 adımları 4.1 ve 4.2 aşağıda Protokolü 2 yukarıdaki başlatmadan önce tamamlanmalıdır. Mikroskop ve bilgisayarı açın Yaklaşık 1-2 saat deneme, başlamadan önce açmak ve sahne en iyi kuluçka 37 ° c Onceden, CO2 5 %’ye ayarlarsanız ve nem % 85 ayarla. Kuluçka makinesi’nın nem oranı depo, boş bırakılmışsa doldurun. Boş bir odacıklı slayt iki açık pozisyonların birinde koyun ve distile su ile doldurun. Oda sıcaklık kontrolü, geribildirim termometre varsa güvenli.Not: geri bildirim termometre varsa, bu “kuluçka sıcaklık” kullanın odası equilibrated doğrulamak için. 39-42 ° C-slaytlar aşağıdan ısı ve yoğunlaşma en aza indirmek için ayarla ikincil bir üfleyici açın. Deneysel slayt eklenene kadar ikinci bir slayt bir boşluk ekleyin. Bu slayt için bireysel wells görüntü alma ayarlarını yapılandırma kurulum sırasında yer yer tutucu olarak hizmet vermektedir. Su kuyuları görüntüleme deneme sırasında koşulları taklit için ikinci slaytta çevreleyen rezervuar ekleyin. Su kuyuları çevreleyen nem değerlendirilmesi sırasında mikroskop kurulum ve ön ısıtma sağlar.Not: Sahne-üst kuluçka ve ikincil üfleyici ön denge kararlı bir kodlamayla ortam korumak için önemlidir. En canlı hücre odası denetleyicileri2ve sistem hazırlık değerlendirmek için nem sıcaklık, CO gerçek zamanlı geribildirim vermek. Etmeden önce slayt üzerinde nem birikimi ve rezervuar 4.1.5 içinde dolu gibi aşırı kurutma için kontrol edin. Nem aşırı kurutma veya yoğunlaşma odasında ise ayarlanması gerekebilir. Nem oranı artırmak için distile su ile ıslak mendil ekleyin. Yoğunlaşma azaltmak için 4.1.1 içinde ayarlanmış gibi nem ayarı azaltın veya kontrol odası sıcaklık ayarları ve ikincil üfleyici konumlandırma yoğunlaşma düşük sıcaklık bir belirtisi olabilir gibi. Denge sırasında temel görüntü alma ayarlarını yapılandırın.Not: resim alma sahne, çekim ve kamera denetleyen bir yazılım yapılandırılır. Bir çok boyutlu kurulum aracı yazılımı yapılandırmak için en kolay yoludur. Ayrıca, yazılımın deneme süresi üzerinde odak denetim sağlamak için otofokus rutinleri olması gerekmektedir. Her şey için birden çok sahne pozisyonları ayarlamak için yazılımı kullanın. Bu iletişim kuralı için kuyu Merkezi’ni seçin. Öyle ki her sahne konumda tüm iyi görüntüsü resim alma yapılandırın. Örneğin, bir tilescan % 10-20 görüntü örtüşme ve yaklaşık 5 x 5 alanları, kamera ve son büyütme bağlı olarak kullanın. Her 15 dakikada görüntüleme için zaman atlamalı yapılandırın.Not: Bu protokol için özetlenen yapılandırma’yı kullanarak, slaytın tüm 15 kuyu 15 dk aralığında yansıma. Deneysel slayt yük Denge kuluçka odası boş slayt deneysel slaytla değiştirmek.Not: bir denge odası istikrarlı sıcaklık, CO2ve nem için en az 20 dk olacak. Deneysel slayt hazır olduğunda, bu adımları hızla “ölü-zaman” en aza indirmek için kaplama ve mikroskop tarafından yakalanan ilk zaman noktası arasında tamamlandığından zorunludur. Ayrıca, görüntüleme deneyler arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için bu sefer tutarlı olması gerekir. Bu deneylerde Protokolü 3 bölümü 4,3 tüm adımları tamamlamak için yaklaşık 30 dakika gerekli. Slayt kapağı çıkarın ve slayt üzerinde wells çevreleyen rezervuar su ekleyin.Not: Görüntüleme deneme süresi için kapağı kaldırılır. Son görüntü alma ayarlarını yapılandırma CFI planı Fluor DL 10 X amaç pozisyonda yerleştirin ve kondansatör Ph1 faz halkada belirleyin. İlk iyi odak ile Köhler aydınlatma diaskopik ışık yolunu ayarlayın ve faz optik objektif faz maskesi ile kondansatör ringde faz hizalamasını kontrol ederek yapılandırın. Pozlama süresi yapılandırmak ve genelde daha az 500 ms olan faz kontrast için lamba yoğunluğunu ayarlayın. Her sahne pozisyon kümede 4.2.1 arasında geçiş yapmak ve iyi Merkezi seçilir ve ayarlamak, gerekirse onaylayın. Her sahne konumundaki hücreleri kuyuda kaplama ve görüntüleme yazılımı için kullanılan sahne pozisyonun z konumunu belirleyin. Mikroskop için otomatik odaklama mekanizması sınayın. Otomatik netleme işlemi donanım tabanlı ise, açık olduğundan ve düzgün bütün sahne pozisyonlar için konumlandırılmış olun.Not: numune ve sahne dikey olarak deneme sırasında drift gibi yazılım her sahne konum ve saat boyunca güvenilir görüntüleme emin olmak için her zaman nokta otofokus denetlemeniz önemlidir. Mümkünse, önceki zaman noktasında belirlenen bir otofokus konumu sonraki otofokus rutin için başlangıç noktası olarak kullanılmalıdır. Bu şekilde devam drift için kolaylıkla ayarlanabilir. Azaltmak ya da mikroskop odasında ışıkları söndürmek ve görüntüleme deneme başlayın. 5. Protokolü 4: Vasculogenesis (KAV) işleme ve Kinetik analizi görüntü Her şey için görüntü yığını olarak bireysel zaman Puan görüntüleri kaydetmekNot: görüntü yakalama için çoğu yazılım çok sayfalı TIFF (stacks) serisi zaman dışa aktarabilirsiniz. KAV birden çok saat noktası içerebilir veri kümeleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Böylece, analiz verilen sahne pozisyon için tüm görüntü yığını üzerinde oluşur. Gerekirse, görüntü işleme yazılımı görüntü yığını yeniden oluşturmak için her zaman noktasından tek görüntüleri içe aktarabilirsiniz. Görüntü işleme yazılımı bilgisayarda açın KAV görüntü işleme yazılımı Ekle KAV dosyayı bir klasörden yazılım penceresinin altındaki gri Çubuğu’na sürükleyin. ‘Kaydet’ yazılım listeye eklemek için tıklatın. Analiz edilecek görüntü yığını açın ‘Dosya’ sonra ‘açılan menüsünden görüntü işleme yazılımı veya adım 5.3.1 olduğu gibi gri Çubuğu’na sürükleyin görüntü dosyası açık’. Görüntüleri için 8 bit ‘Resim’, ‘Tür’, ‘8 bit’ i tıklatarak dönüştürmek. Faiz (ROI) bölgesi oluşturma ROI Yöneticisi araç çubuğunda ‘Analiz et’ ı tıklatarak açın. Sonra ‘Araçlar ‘ ROI Yöneticisi tarafından ‘ takip’ seçin. Yeni bir yatırım Getirisi üzerinde daire veya dikdörtgen seçim araçları araç çubuğunda tıklatın ve görüntüde istediğiniz seçim alanı çizme oluşturun. ‘Bu şekli kaydetmek için Ekle’yi ROI Yöneticisi penceresinde tıklatın.Not: Önceden oluşturulmuş bir yatırım Getirisi ROIs (sıkıştırılmış klasör) kaydedilen sürükleyerek Yöneticisi’nde açmak için ‘Sürükle ve bırak’ çubuğuna açılabilir. Yatırım Getirisi üzerinde resmi görebilmek için Yöneticisi’nde listelenen ROI etiketi tıklatın.Not: yatırım Getirisi görüntüde görünmez Eğer ikinci bir yatırım Getirisi (herhangi bir boyut/şekil) oluşturun ve Yöneticisi için ekleyin. Her ikisi de ROIs listede yer, ve geriye ikisi arasında istenen ROI görüntüde görünür zamanlar ve. ROI gerekirse hizalayın. ROI istenilen yere görüntüde yaptıktan sonra menüsüne gidin ve “sonra”Açık dışında”Düzenle” yi tıklayın. Bu yığındaki her görüntü için yatırım Getirisi (dikdörtgen olmayan şekiller için yararlı) dışında görüntü verileri siler.Not: rectangularly şeklinde bir yatırım Getirisi kullanıyorsanız, ‘Resim’ ve ‘Ürün’ tıklatabilirsiniz. KAV yazılımı çalıştırmak ‘Eklentiler’ menü çubuğu’nu tıklatın. ‘Ağ analiz’ seçin eklentisi. Bu eklentiyi ayarlarında değişiklik yapmak seçenekleri ile bir pencere açılacaktır. Belgili tanımlık damla aşağı oku kullanarak eşik yöntemini değiştirin. Tüm uygun ayarları seçildikten sonra yazılımı işlem başlatmak için ‘ Tamam’ tıklatın.Not: Uygun ayarları yazılımının belirlemek ve hücreleri ve faz kontrast görüntü arka planda gelen ağların ayırt accurary göstergesi olan KAV tarafından üretilen iskelet ve maske yorumlamalar görselleştirme yoluyla belirlenir. KAV tarafından oluşturulan veri kaydetme Eklentiyi çözümlemeyi tamamladığında, iki windows pop-up sayısal değerler ve erimiş görüntüleri iskelet ve maske yorumlamalar tasvir eden bir yığın bir veri tablosunda da dahil olmak üzere ekranda olacak. Sayısal değerler veri tablosunun sol üst köşesinde giderek kaydedin ve tıklatarak ‘Düzenle’ sonra ‘kopya’ veya ‘değerleri bir excel elektronik tablosuna yapıştırmak için kesme’. Erimiş iskelet ve maske resmine tıklayınız. Erimiş iskelet/maske görüntü yığını ” TIFF.’ dosya,’ ‘Farklı Kaydet’ ı tıklatarak bir etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası olarak kaydedin Kırpılan faz kontrast kaydetmek görüntü yığını (ROI kullanılarak oluşturulan) ‘, ‘Farklı Kaydet’ ‘TIFF.’ dosya’ tıklayarak ROI yöneticisi penceresini tıklatın ve kırpma görüntüleri için kullanılan YG seçin. ‘Daha’ ‘yatırım Getirisi ileride kullanmak için kaydetmek için Kaydet’ ve ardından’ı tıklatın.Not: aynı YG analizler arasında tutarlılığı korumak yardımcı olacaktır kullanma.

Representative Results

KAV ağ yapısı görsel gösterimleri üretenECFCs ve matris arka planda faz kontrast görüntüler arasındaki kontrast cep özel yapıları belirlemek KAV sağlar. ECFC ağlar KAV tarafından tanımlanan pictorially iskelet ve maske yorumlamalar olarak yazılım tarafından kullanılan miktar (Şekil 2A) yapıları göstermek için temsil edilir. Önemlisi, iskelet ve maske yorumlamalar nitel değerlendirilmesi KAV hassasiyet ve doğruluk, en uygun eşik ayarlarını belirleme ve analiz sonuçları yorumlama yararlı olabilir hızlı kimliği sağlar. Faz kontrast görüntü kalitesinin yüksek olması ve yeterli kontrast elde edilir, KAV doğru ECFC ağlar arasında benzerlik faz kontrast görüntü ve KAV tarafından üretilen iskelet ve maske yorumlamalar (Şekil 2 gösterildiği gibi tanımlar A ve Video 1). Alternatif olarak, faz kontrast görüntüler yüksek karşıtlık ve/veya uygun ortaya gibi görüntüleme eserler varsa, ağ algılama doğruluğu azalır ve sonuçları belirsiz (Şekil 2B) olmak. Ayrıca, hücre ortam içinde hava kabarcıkları oluşumu da algılama hassasiyeti (Şekil 2) belirsiz. Ancak, görüntü kalitesi ile ilgili sorunlar genellikle KAV yazılımını farklı eşik yöntemleri yelpazesi ile üstesinden gelebilir. Örneğin, Şekil 2B faz kontrast görüntü aynı görüntü işleme ayarları dışında eşik yöntemi kullanılarak analiz. İskelet ve maske yorumlamalar Otsu eşik faz kontrast resim (Resim 2B) gösterilen ECFC ağlar daha doğru algılamaya sonuçlandı belirgindir. Bu nedenle, görüntü kalitesi bu tahlil doğru ve anlamlı sonuçlar elde edilmesi için önemlidir. Ancak, KAV kullanıcı arabiriminde dahil farklı eşik yöntemleri girdi görüntüsü kalitesinebakarak görüntü analizi ayarlanmasına izin. Hızlandırılmış mikroskobu intrauterin Gestasyonel diyabet pozlama takip ECFC vasculogenesis nitel ve nicel farklılıkları tanımlarSon zamanlarda, KAV analitik yaklaşım anne tip 2 diabetes mellitus (T2DM) rahim içinde16maruz takip fetal ECFC işlevini değerlendirmek için uygulandı. KAV kullanarak, vasculogenesis değişmiş Kinetik tespit edildi içinde fetal ECFCs T2DM için maruz. Ancak, T2DM yanı sıra tüm gebelik, Gestasyonel diabetes mellitus (GDM) veya gelişiminde glikoz intoleransı genellikle gebeliğin üçüncü üç aylık boyunca oluşur, pozlama da ECFC işlevi13bozar. Bu nedenle, KAV GDM maruz ECFCs Ayrıca ECFC ağ oluşumu değiştirilen Kinetik görüntülemek belirlemek için uygulandı. Aşama 1 (0-5 h) ve Faz 2 (5 + s) değerlendirildi istimal zaman atlamalı mikroskobu birleştiğinde ile KAV analizi (şekil 3). Temsilcisi faz kontrast görüntüler resim alma (0.50 h) başlangıcında alınan ve saat ders (5,00 ve 10.00 h) boyunca tek bir deneysel günden beri (şekil 3 ve Video 1 test dört örnekleri ECFC ağ oluşumu tasvir ). Yükleme, faz kontrast Albümdeki 0,50 saat gibi eşdeğer hücre rağmen nitel ağ yapısı farklılıkları 5,00 ve 10.00-saat zaman noktalarda belirgindir. ECFCs komplikasyonsuz gebelik (UC) üzerinden 5 saat, bizim için daha önce yayımlanmış veri16benzer sonrası kaplama karmaşık ve karmaşık bir ağ oluşturur. Tersine, ECFCs GDM üzerinden çok az değil birbirine yapıları ağ 1 (GDM1) formu örnek. Ancak, bu model GDM gebelikler, heterojenlik örnekleri arasında göstergesidir elde edilen tüm ECFC örneklerinde yansıtılmaz. Bağlantı şekillerinin UC örneğe göre değişmiş gibi görünse de örnekleri GDM2 ve GDM3 GDM1 için göre daha fazla ağ oluşumu görüntüler. Önemlisi, KAV ECFC ağlar açık ve ince fenotipleri tanımlamak için çeşitli yapısal bileşenlerini ölçer. Ağ yapısı iskelet ve maske renditions üreten ek olarak, KAV bireysel ağ yapıları, düğümleri, üçlü dallı düğümleri, dört kez dallı düğümleri, dalları, toplam sayısı dahil olmak üzere ağ yapısının on ölçümleri quantitates Branş uzunluğu, ortalama branş uzunluğu, düğüm oranı, toplam Şube kapalı ağlar ve ağ alanı16. KAV her örnek için veri değerleri zaman tabii tüm görüntüler için tek bir tabloya derler. Tablo 1 bir ECFC örnek için bir görüntüleme çalışmada temsilcisi ham verileri içerir. Ağ yapısı KAV tarafından ölçülen parametrelerin sütunlara düzenlenir ve zaman içinde alınan sıralı görüntüleri için verileri satırlara organize edilir. İçin örnek, bizim çalışmaları, Resim 1 sonraki görüntüler varlık tarafından oluşturulmuş her 15 dk. ham değerleri toplanan ile 30 dk sonrası kaplama elde KAV sonra grafiği çizilecek veya daha fazla analiz kullanarak daha karmaşık istatistiksel16yaklaşıyor. Beş grafikler üç ayrı deneyler üzerinden ağ yapısının ortalama değerleri gösteren tek bir basit örnek (UC) ve üç GDM örnekleri (şekil 4) için gösterilir. Benzer şekilde daha önce yapılan deneyler bu UC örnekte UC örnekleri16analiz. Daha önce ECFC vasculogenesis içinde vitro BI-Aşama 1 (0 – 5 h) oluşan phasic, ve 2 (5-10 h)16faz tespit edilmiştir. Bu desen olarak kapalı ağ verisi (şekil 4) gösteren grafik tarafından kanıtlanan mevcut çalışmalar içinde tutarlıdır. UC örnek kapalı ağlar GDM örnekleri için üç karşılaştırıldığında daha fazla sayıda kurdu. İlginçtir, üç dört örnekleri 2.5 ve 3 saat arasında oluşan kapalı ağlar, maksimal sayısı için benzer bir zaman var gibi görünüyor. Ancak, GDM2 örnek 5 saat sonrası kaplama oluştu maksimal kapalı ağlar ulaşmak yavaş. Ve UC örneğe göre daha az maksimal ağları oluşturan GDM2 örnek rağmen bu formlar ağlar benzer şekilde UC örnek zaman içinde muhafaza. Tersine, GDM1 ve daha az ağlar UC örneğe göre oluşan GDM3, aynı zamanda ağ numarası genel bir azalma zamanla sergiledi. Örnekler üzerindeki oluşumu oranı ve elde ağlar maksimal sayısı değişir ancak genel olarak, kapalı ağ numarasını gösteren grafikten bu tüm ECFC örneklerini ağ oluşumu, BI phasic bir model görüntülenen açıktır. Ağ alan ECFCs tarafından kurulan kapalı ağları içerisinde ortalama alanı temsil eder. Bu nedenle, büyük kapalı ağ numarasını küçük ağ alanlarında. Bu model kapalı ağlar daha çok sayıda oluşan, UC örnek üç GDM örnekleri (şekil 4) göre zaman içinde küçük ağ alanları vardı nerede ağ alan grafikleri yansıtılır. Maksimal kapalı ağlar daha yavaş ulaştı, GDM2 yüksek ağ alanı başlangıçta sergiledi, ancak zaman içinde ve bu alan stabilize 15 saat en UC örneğe benzer. Zamanla, tüm örnekleri ortalama ağ alanında Ağ de-istikrar nedeniyle arttı. Ancak, bazı örnekleri, GDM1 ve GDM3, azalan istikrar daha aşamalı bir artış sergileyen diğer örnekleri karşılaştırıldığında büyük olasılıkla gösterge ağ alanında daha hızlı bir artış sergiledi. Azaltılmış ağ istikrar GDM maruz ECFCs sergiBir roman fenotip KAV tarafından hesaplanır ve bizim önceki çalışmalarda tespit dalları düğümlere oranıdır ve bu ağ bağlantısı16tane göstergesidir. Mevcut çalışmada, UC örnek (şekil 4) Zaman içinde devam edildi ağ bağlantısı yüksek düzeyde temsil düşük bir oranı vardı. Bunun tersi olarak, üç GDM örnek ağ oluşumu özellikle Phase 2 şube düğümlerine, daha yüksek bir oranı vardı. Bu gözlem sınırlı bağlantı ve ağ yapıları de-sabitleme gösterir. Genel olarak, GDM1 daha az düğümleri ve diğer örnekleri deneme boyunca tutulan azaltma ile karşılaştırıldığında dalları kurdu. GDM2 ve GDM3 oluşan ve dalları UC örnek, 5-15 h arasında özellikle karşılaştırıldığında daha fazla sayıda saklanır. GDM2 ve GDM3 ağlar algılandı düğüm numaralarını daha UC örneğinde, özellikle arasında 10-15 h düğüm sayısı benzerdi. Dalları daha fazla sayıda, ancak düğümler, benzer bir dizi düğümü oranı artan şube GDM örnekleri daha yeni zaman noktalarında belirgin hesap. Önemlisi, şube ve düğüm numarası eşzamanlı değişiklikleri ayrı grafiklerde yorumlamak zor olabilir. Ancak, düğüm oranı roman şube nasıl küçük değişiklikler bireysel grafiklerde, şube ve düğüm numarası, tespit etmek zor da dahil olmak üzere, değiştirilmiş ağ bağlantısı’nda değiştirilmesinden değerlendirmek için bir yol sunar. Resim 1 : 10 parametre Kinetik analizi, Vasculogenesis (KAV tarafından) sayısal özetleyen şematik. KAV ağ yapısının on farklı parametreleri quantitates. Tüm parametreleri şematik içinde sayısal olarak (1-10) ana hatlarıyla ve renk kodlu. Parametreler yer dalları (yeşil, 1), kapalı ağlar (mavi, 2) sayısı ve düğümleri (kırmızı, 3), ortalama ağ alan (portakal, 4), ağ yapıları (siyah, 5), üçlü dallı düğümleri (sarı, 6) ve dört dallı düğümleri (mor, 7), dizi olarak Toplam (9) ve ortalama (10) şube uzunluğu ve düğüm (10) sayısı için Şube sayısı oranı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Kinetik analizi, Vasculogenesis (KAV) ağ yapısı quantitates. (A)yorumlamalar faz kontrast görüntüler tespit ve KAV tarafından sayısal ağ yapıları görsel gösterimini sağlar kullanarak KAV ile tanımlanan ağ yapıları iskelet ve maske. Ölçek çubuğu 500 µm düşük kontrast ve kılavuz olan ECFC ağlar 10 h sonrası kaplama bir temsilcisi faz kontrast görüntü işaretler tek tek görüntüleri birlikte dikiş. (B) =. Ortalama veya Otsu, gibi farklı eşik yöntemleri faz kontrast görüntüler düşük kontrast varsa veya uygun durumda Nefelometri doğruluğu artırmak için KAV eklentisi seçilebilir. Faz kontrast görüntü iskelet ve maske renditions ortalama ve Otsu eşik yöntemler için gösterilmektedir. Faz kontrast görüntüleri 10 X amacı istimal ele geçirildi. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : İntrauterin GDM pozlama değiştirir ECFC ağ oluşumu. ECFC ağ oluşumu görüntülerini 15 h için 15 dk aralıklarla faz kontrast mikroskobu tarafından ele geçirildi. Temsilcisi faz kontrast görüntüler (0,5 h), kaplama sırasında başlayan 5 h aralıklarla, UC ve üç GDM örnekleri için gösterilir. Faz kontrast görüntüleri 10 X amacı istimal ele geçirildi. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : İntrauterin GDM değişmiş sergi ağ oluşumu Kinetik için maruz ECFCs. ECFCs bir komplikasyonsuz gebelik (UC, siyah) ve Gestasyonel diabetes mellitus (GDM 1-3, kırmızı) tarafından karışık üç gebelik elde. Faz kontrast görüntüler 15 dk kapalı aralıkları 15 h. quantitated Kinetik analizi, Vasculogenesis (KAV) yazılım için ağları, ağ alanlarında, dalları, düğümler ve dalları düğümlere oranını ele geçirildi. Resimli verileri her örnek için üç ayrı deneyler (SEM) ortalaması ortalama ± standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Video 1: İntrauterin GDM pozlama değiştiren Kinetik ECFC ağ oluşumu. ECFC ağ oluşumu görüntülerini 15 h için 15 dk aralıklarla faz kontrast mikroskobu tarafından ele geçirildi. Faz kontrast görüntüler UC ve üç GDM örnekleri 15 h üzerinden 0,5 h başlangıç için gösterilir. Ölçek çubuğu 500 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.) Görüntü Toplam şube ağları Düğümleri Üç katına Dört Kişilik Dalları Toplam şube uzunluğu * AVG şube uzunluğu * Şube düğüm oranı Kapalı ağlar Ağ alanı ** 1 382 290 278 11 943 47210 124 3,25 9 480214 2 284 345 337 8 940 50699 179 2.72 16 264469 3 205 376 366 9 910 55728 272 2.42 27 150621 4 162 422 407 15 947 59692 368 2,24 40 98713 5 132 454 441 12 967 61923 469 2,13 53 72951 6 122 435 419 14 907 62587 513 2.09 68 56948 7 88 429 411 17 852 63983 727 1,99 74 51429 8 68 451 437 13 874 63960 941 1,94 74 51780 9 93 437 417 18 905 60901 655 2,07 49 82919 10 126 511 487 24 1075 61981 492 2.1 37 116857 11 49 397 384 12 737 61823 1262 1.86 79 48805 12 81 376 364 10 751 56817 701 2 63 64431 13 98 509 482 26 1028 60799 620 2,02 44 98056 14 93 449 416 31 909 58282 627 2,02 45 94081 * yakın mikron için yuvarlak ** için yakın mikron yuvarlak ^ 2 Tablo 1: Bir görüntüleme temsilcisi ham verileri bir ECFC örnek için eğitim.

Discussion

Büyük veri setleri ile birden fazla zaman Puan değerlendirilmesi KAV sağlar
Geleneksel olarak, vasculogenesis vitro Nefelometri tek bir veya birkaç zaman noktası ölçümleri oluşuyordu. Bu statik yaklaşım sadece yakalamak ve dinamik ve karmaşık bir süreç miktarının için yetersizdir. Bu nedenle, bu roman yöntemi ağ oluşumu Kinetik potansiyel moleküler mekanizmaları vasculogenesis dinamik sürecine dahil bir anlayış kazanmak için verimli analizlerini etkinleştirmek için geliştirilmiştir. Verimlilik ve otomasyon oluşturmak ve büyük miktarlarda görüntüleme verileri çözümlemek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde önemli bileşenleridir. KAV, özellikle zaman ve emek hızlandırılmış veri kümelerinden biyolojik olarak anlamlı sonuçlar türetmek için gerekli azaltmak için görüntüleri yüzlerce oluşan büyük görüntü yığınları analiz etmek için geliştirilmiştir. Önemlisi, KAV yürüten görüntü işleme ve bir konuda veri nesil için küçük (daha az 100 adet fotoğraf) saniye görüntü yığınları ve dakika daha büyük (100 adet fotoğraf büyüktür) görüntü yığınları, eşsiz verimlilik kaynaklanan. Ayrıca, elektronik tablo içine veri kuruluş zaman ve ölçülen parametreler tarafından hızlı nesil grafik sunumu ve istatistiksel analiz sağlar.

Bu yaklaşımın başarılı uygulamada zorluklar
Bu tahlil resim alma ve analiz iyileştirmeler içeriyor olsa da, bazı zorluklar başarıyla yürütülüp yürütülmediğini engelleyebilir. Dört ana engelleri nem istikrar, kaplama zamanlama hassas resim alma, yazılım ve donanım güvenilirlik ve yönetim her deneme için oluşturulan büyük veri kümeleri içerir. Birkaç saat boyunca istikrarlı canlı hücre görüntüleme zor olabilir. Özel olarak, uygun ve tutarlı nemlendirme görüntüleme salonları için gereklidir. Angiogenez slaytlar bu tahlil hangi matris tabanlı angiogenez deneyleri parallelizing için tasarlanmıştır kullanılır. Onların düşük hacimli, yaklaşık 50 µL, buharlaşma ve yoğunlaşma genişletilmiş kültür koşulları için önemli konuları Deneysel bu konu ile mücadele için nem düzenleyen bir kuluçka kullanmak gereklidir. Ancak, ayrıca aşırı görüntüleme TMMOB kurutma zaman içinde oluşursa bu yönetmelik çoğaltmak için gerekli olabilir. Bulduk nem oranı artırmak için en basit yaklaşım odasında su yüzey alanı artırmaktır. Bu amacı gerçekleştirmek için aşağıdaki üç su kaynakları bizim protokol öneriyor: ikinci bir odacıklı slayt aynı zamanda nerede kuluçka sıcaklık ölçülür, su kuyuları slaytlar ve ıslak filtre kağıdı çevresi su veya mendil. Diğer taraftan, yoğunlaşma odada hava sıcaklığı slaydın alt soğur ve nem odası içinde slaytlar ve wells üzerinde yoğunlaşması oluşur. Bu sorun hücre medya ve faz kontrast ile engelleyen bir lensing etkisi bir seyreltme yol açabilir. Bu çalışmalarda, yoğunlaşma aracılığıyla ısıtmalı hava (39-42 ° C) slayt alt üzerine uygulanması en aza.

Bir anahtar için herhangi bir hızlandırılmış eğitim deneme başlatma ve görüntüleme arasında tutarlılığı noktadır. Ne zaman aşağı akım olaylar yorumlanması için kritik başlatır görüntü zamanlaması. Bu tahlil zamanlama duyarlığını emin olmak için zaman ilk kaplama ve ilk görüntülü zaman nokta arasındaki sıkı denetlenmelidir. Uygulamada, bu “ölü zaman” en aza indirilebilir ama daha da önemlisi, bu deneyler karşılaştırılmak üzere farklı günlerde izin vermek için tutarlı olması gerekiyor. Örneğin, bu protokol için yaklaşık 30 dakika ölü bir süre bekliyoruz. Bu deneysel hazırlık ve İmkanları Imaging yakınlık tarafından kolaylaştırılabilir.

Sıradan ayrıntıları ilk bakışta yazılım, donanım istikrar ve veri yönetimi için önemlidir gibi ne görünebilir. Yazılım ve ilgili donanım sürücüleri, ağ ortamı ve otomatik yazılım güncellemeleri tüm etkiler yazılım istikrar. Bu protokol bir kuru darboğazları ve resim alma; sorunları potansiyel kaynakları tanımlamak için “Çalıştır” için test değer olduğunu Örneğin, güvenilir olmayan canlı hücre Kur, sahne, çekim ve kamera güvenilirlik ve kurumsal bilgi teknolojisi ilkeleri otomatik işletim sistemi ve yazılım güncelleştirmelerini denetleyin.

Veri yönetimi görüntüleri binlerce yüzlerce üretir görüntüleme herhangi bir deneme devam eden bir husustur. Neyse ki, ticari yazılım kez görüntüleme deney başlamadan önce kullanılabilir alanı denetler. Ancak, bu tahlil de çekim sonrası görüntü işleme ve sabit disk alanı yük ekleyebilir ve kullanılabilir alan sınırlıysa deneyler, Imaging ile müdahale analiz içerir. Ayrıca, güvenlik ve istikrar bilgisayarın, özdeş diskler yedek dizisi gibi donanım çözümleri ile bile garanti edilemez. Böylece, devam eden deneyler ve bir sağlam uzak, örneğin bir kurumsal arşivleme kaynak ile arşivleme için bilgisayarın sabit sürücülerde alan sağlamak için bir veri yönetimi stratejisi gereklidir.

Görüntü kalitesi en üst düzeye çıkarmak için stratejiler
KAV doğru ECFCs matris kökenli ayırt yeteneği sağlam olsa da, testin duyarlılığı görüntü kalitesine bağlıdır. Örneğin, görüntünün düşük kontrast varsa, yazılımı daha az doğruluk (Şekil 2B) ile hücre ağları bulur. Faz kontrast kalitesini mikroskop resim alma için kullanılan ayarları dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından etkilenen tahlil hazırlık ve medya düzeyleri kuyuları içinde bakım sırasında matrix ve hücre süspansiyon medya yükleme görüntüleme boyunca. Faz kontrast bu deneyleri için en iyi duruma getirmek için faz yüzük uyum içinde mikroskop küçük ayarlamalar karşıtlığı artırmak için yapılmıştır. Ayrıca, numune hazırlama titizlikle eşit ve tutarlı medya yükleme sağlamak için test edildi. Matris ve/veya kuyu yüklenen medya miktarı altında veya üstünde optimum aralığı ise bir Menisküs değişmiş faz kontrast için önde gelen oluşabilir. Son olarak, sıvı Wells küçük hacimli nedeniyle, buharlaşma ve yoğunlaşma, yukarıda da belirtildiği gibi en aza indirerek medya seviyelerini korumak önemlidir. Genel olarak, tahlil optimizasyonu analiz için yüksek kaliteli kontrast görüntü oluşturmak için önemlidir.

Faz kontrast kalite ek olarak, diğer faktörler de tahlil sonuçları matris ve parçacıklar kusurları veya enkaz matris veya medya medya kirlenme, dahil olmak etkileyebilir. Birkaç saat boyunca canlı hücre görüntülemede mikroskobu odası gerektirdiğinden kirlenme tehlikesi Bu testin var. Bulaşma riskini azaltmak için matris ve hücre süspansiyonlar steril başlıklı slayt üzerine yüklenir. Buna ek olarak, her örnek genellikle yinelenen veya nüsha enkaz veya analiz semptomlarıdır parçacıklar gibi öngörülemeyen sorunlar nedeniyle veri kaybı riski en aza indirmek bir deney için kaplama.

Örnek heterojenite sürücüler için artan tahlil duyarlılık gerek
Heterojenite gözlenen ve GDM13için maruz ECFCs önceki çalışmalarda bildirdi. Heterojenite bu örnekler içinde gözlenen hücre işlevindeki yüksek düzeyde önem maternal hastalık, hastalık ve kan şekeri düzenleyen için kullanılan yönetim tarzı süresi dahil olmak üzere çeşitli faktörler atfedilebilecek olması düşünülmektedir. Önemlisi, bu analitik yaklaşım uygun işlevsel heterojenite nedeniyle GDM gebelik fenotipik farklılıklar örneklerinde tanımlamak için yapım o dinamik aralığı ECFC vasculogenesis yakalar. Genel olarak, bu çalışmalarda kullanılan olanlar gibi birincil hasta numuneleri kullanımı bir hücre satırı ile karşılaştırıldığında daha büyük değişkenlik tanıtabilirsiniz. Daha fazla önem translasyonel çalışmalar birden fazla birincil hayvan veya insan örnekleri ile fonksiyonel değişkenlik içeren yerleştirilir gibi algılama ve biyolojik olarak anlamlı ölçümleri ve sonuçlarına türetme için tahlil duyarlılık önemlidir. Bu nedenle, geliştirme gibi KAV miktarı ve verilerin kalitesini artıracak yaklaşımlar deneyleri daha sağlam gözlemler ve sonuçlar sağlamak için vitro vasculogenesis ve anjiogenezi tarafından üretilen. Ayrıca, bu veri intrauterin GDM pozlama aşağıdaki değiştirilmiş ECFC vasculogenesis katkıda temel moleküler mekanizmaları gelecekteki incelenmesi kolaylaştıracaktır.

Bu yaklaşımın gelecekteki uygulamalar
Her ne kadar bu çalışmalarda fetal ECFC vasculogenesis vitro değerlendirmeye uygulanan bu yöntem, bu yaklaşımın potansiyel uygulamalar çoktur. Bu teknik, vasculogenesis veya angiogenez süreçlerinde yer aldığı herhangi bir hücre nüfus çalışmaya kolayca uygulanabilir. Özellikle, bu çalışmada gösterildiği tek tek hücre popülasyonlarının, çalışma için kullanılabilir, ancak aynı zamanda ortak kültür sistemleri için uygulanabilir. Gelecekte, bu yaklaşım üç boyutlu (3D) modelleri değerlendirmek için iki boyutlu vitro tahlil ötesinde genişletmek faydalı olacaktır. Şimdiki yorum-in KAV veri düşsel 3D quantitating için yeterli olacaktır rağmen iki-boyutlu olarak gözlemler yapılmış 3D veya vivo içinde modelleri için özel olarak benzer şekilde tasarlanmış bir hızlandırılmış, çok parametrik analitik yaklaşım bilgilendirmek vitro hücre işlevi daha biyolojik ilgili bir ortamda temsilcisi vardır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr David Haas, Brittany Yeley (Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew dönmek ve Emily Sims (Anjiyo BioCore Indiana Üniversitesi Simon Kanser Merkezi) için kabul Mükemmel teknik yardım ECFC örnekleri türetme. Yazarlar ayrıca Drs. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. gün, Mervin C. Yoder ve Matthias A. Clauss (Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi) yanı sıra Janice duvarlar (Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi) için bilimsel tartışma için kabul İdari destek. Tüm görüntüleme biyolojik mikroskobu, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Indiana Merkezi’nde gerçekleştirildi. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 HL094725, P30 CA82709 ve U10 HD063094) ve Riley çocuk Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu yayının Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü # T32 HL007910 altında kısmi desteği ile mümkün yapıldı.

Materials

100mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15ml conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10x
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. . ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
  15. . WimTube Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012)
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).

Tags

VasculogenesisAngiogenesisKinetic AnalysisLive-cell ImagingQuantitateVessel FormationNetwork Structural PatternsCell PopulationPathologic StateMicroscope Stage Top IncubatorCarbon DioxideHumidityLive-cell ChamberChambered SlideBasement Membrane MatrixMatrigelPipetting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image