Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden
Summary
We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.
Abstract
Intestinale organoïde culturen bieden een unieke kans om te onderzoeken intestinale stamcel en crypt biologie in vitro, hoewel efficiënte benaderingen voor het manipuleren van genexpressie in organoïden beperkte vooruitgang in deze arena hebben gemaakt. Hoewel crispr/Cas9 technologie het mogelijk maakt om cellen te bewerken voor organoïde generatie, vereist deze strategie een uitgebreide selectie en screening door sequentieanalyse, wat zowel tijdrovend als kostbaar is. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor efficiënte virale transductie van intestinale organoïden. Deze aanpak is snel en zeer efficiënt, waardoor de tijd en kosten die inherent zijn aan CRISPR/Cas9 technologie afnemen. We presenteren ook een protocol voor het genereren van bevroren delen van intacte organoïde culturen voor verdere analyse met immunohistochemische of immunofluorescentie kleuring, die kan worden gebruikt om genexpressie of uitschakeling te bevestigen. Na succesvolle transductie van virale vectoren voor genexpressie of geluids dempings wordt bereikt, kunnen de intestinale stamcel en de crypte functie snel worden beoordeeld. Hoewel de meeste organoïde-onderzoeken in vitro testen gebruiken, kunnen organoïden ook bij muizen worden afgeleverd voor in-vivo-functionele analyses. Bovendien zijn onze benaderingen voordelig bij het voorspellen van therapeutische reacties op geneesmiddelen, omdat momenteel beschikbare therapieën doorgaans functioneren door het moduleren van genexpressie of eiwit functie in plaats van het genoom te veranderen.
Introduction
De mogelijkheid om te cultuur muis of menselijke crypten cellen als driedimensionale (3D) organoïden uit de dunne darmen of dikke darm over langere tijd perioden voorzien van een grote doorbraak, omdat deze culturen weergeven definiëren kenmerken van intestinale epitheel in vivo 1 , 2 , 3. organoïden afgeleid van primaire crypten zijn in staat om zelf vernieuwing en zelforganisatie, exposeren cellulaire functies vergelijkbaar met hun weefsels van oorsprong. Inderdaad, organoïden recapituleren niet alleen de structurele organisatie van crypten in vivo, maar ook veel moleculaire kenmerken, waardoor het verstrekken van nuttige instrumenten om normale biologie en ziektetoestanden te bestuderen. Ter illustratie, organoïde studies hebben aangetoond dat nieuwe moleculaire trajecten die betrokken zijn bij weefselregeneratie1,2,3,4,5 en geneesmiddelen die de functie kunnen verbeteren in pathologische instellingen6,7.
De studie van intestinale stamcellen is van bijzonder belang omdat de intestinale voering behoort tot de meest zeer regeneratieve zoogdier weefsels, die zich elke 3-5 dagen vernieuwt om het organisme te beschermen tegen bacteriën, toxines en andere pathogenen binnen de intestinale lumens. Intestinale stamcellen (iSCS) zijn verantwoordelijk voor dit opmerkelijke regeneratieve vermogen en bieden zo een uniek paradigma voor het bestuderen van de volwassen stamcel functie1,2. Lineage-tracing experimenten bij muizen toonden aan dat geïsoleerde Lgr5-positieve stamcellen gekweekt kunnen worden om 3D-organoïden of ‘ mini-Guts ‘ in vitro te genereren, waar ze hun in vivo-tegenhangers nauwkeurig weerspiegelen. Organoïde culturen kunnen ook worden afgeleid van intestinale crypte van cellen die bestaan uit voor ouders, ISCs en Paneth, waarvan de laatste de epitheliale niche cellen in vivo vormen. In feite is de organoïde cultuur uit primaire intestinale crypte cellen geëvolueerd tot een relatief routinematige techniek die gemakkelijk te implementeren is in de meeste laboratoria met behulp van algemeen beschikbare reagentia. Dit model is ook vatbaar voor kwantitatieve analyse van genexpressie door RNA-sequencing (RNA-SEQ) en eiwitten door massaspectrometrie, Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring2,4,8. Daarnaast kan functionele genetica worden bestudeerd met behulp van gain-of-function (gen-overexpressie of expressie van een activerend Mutant gen) of verlies van functie (gen-uitschakeling of expressie van een verlies-van-functie Mutant) benaderingen2.
Belangrijk, laag rendement en hoge toxiciteit van standaard plasmide DNA of virale transductie protocollen met polybrene blijven een grote hindernis in het veld. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie een precieze genoom bewerking mogelijk maakt, vereist deze aanpak tijdrovende selectie gevolgd door sequentie validatie9. Hier presenteren we een virale transductie protocol voor primaire intestinale organoïden dat de levering van virale deeltjes optimaliseert door conjugatie aan magnetische nanopartikels en de toepassing van een magnetisch veld. Belangrijke wijzigingen in de voorafgaande protocollen4,5,10,11,12,13 en aanbevelingen ter verbetering van de efficiëntie worden verstrekt. We beschrijven ook een aanpak voor het genereren van bevroren secties van intacte organoïden gekweekt in 3D matrigel (hierna te noemen kelder membraan matrix of matrix) voor verdere analyse met immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primaire cultuur van volwassen intestinale epitheel als organoïden biedt een krachtig hulpmiddel om moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij stamcel functie, intestinale epitheliale homeostase en pathologie1,2,3, 4. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie kan worden gebruikt voor genetisch gemanipuleerde organoïden9, wordt het beperkt door de noodzaak van u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), het Maryland stamcel Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de American Lung Association, het Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund en de Hopkins spijsverterings ziekten Basic Research core Center.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
