להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

כאשר תאים B לאגד מקוטב מערכים של אנטיגנים (למשל, המוצג על פני השטח של אנטיגן תאים (נגמ שים)), וכתוצאה מכך B-cell הקולטן (BCR) איתות כוננים היווצרות של מבנה קלאסי סינפסה המערכת החיסונית, אשר היה הראשון המתואר T תאים^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13}. בתחילה, microclusters בצורה BCRs אנטיגן מכורך בפריפריה של התא B: APC פנה אל האתר. אלה microclusters לאחר מכן להזיז לכיוון המרכז של האתר קשר אנטיגן, איפה הם מזג לתוך אשכול מרכזי ההפעלה סופרא מולקולרית (cSMAC) המהווה הליבה של הסינפסה המערכת החיסונית. סינפסה המערכת החיסונית היווצרות מייעל BCR איתות ומקל אנטיגן בתיווך BCR החילוץ של קרום APC¹⁴. רכישה זו אנטיגן, שבעקבותיה באה אנטיגן בתיווך BCR הפנמה ועיבוד אנטיגן עוקבות, מאפשר תאי B להציג פפטיד: MHC II מתחמי לתאי T וירתקו את תא T עזרה¹⁴. כי המערכת החיסונית סינפסה היווצרות מקדם תא B הפעלה, שחקרתי את המנגנונים המקימים שזה דפוס פונקציונלי של קולטן הארגון יכול לספק חדש תובנות תגובות חיסוניות ההורמונאלית איך יזם, מוסדר.

ארגון מחדש של אקטין והן microtubule cytoskeletons חיוני עבור המערכת החיסונית סינפסה היווצרות. BCR מקומי איתות מגורה על ידי מערך מקוטב במרחב של אנטיגנים גורם מהירה ודרמטית שיפוץ של אקטין שלד התא^1,15. היווצרות של אקטין דנדריטים מבנים בפריפריה של תא B מפעילה כוחות לדחוף על קרום פלזמה ומקדם תא B הפצת. זה מאפשר התא B לסרוק אזור רחב יותר מניבי אנטיגן פני השטח, מגדילה את מספר BCRs אשר מאגד אנטיגן ולהפעיל BCR מסלולי איתות. במקביל, MTOC את הרשת microtubule הם reoriented כלפי האתר של אנטיגן קשר. MTOC מתקרב האתר קשר אנטיגן, microtubules שמקורם MTOC להאריך לאורך הפנים הפנימי של קרום פלזמה על הממשק בין התא B לבין משטח אנטיגן מניבי^16,ה-¹⁷. Microtubules juxtamembrane אלה יכולים לשמש ואז רצועות עבור תנועת צנטריפטלי בתיווך דינאין של אנטיגן מכורך BCR microclusters¹⁸, שמוביל היווצרות cSMAC.

ולהתפכחות קיטוב של MTOC לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית דורש אקטין שלם microtubule cytoskeletons ואת תלויים אינטראקציות בין אקטין קורטיקלית microtubules ורשת^{16,17, 19,20}. החלבונים אקטין-איגוד בקליפת המוח, כגון IQGAP1, באפשרותך ללכוד microtubules על ידי אינטראקציה עם מתחמי חלבון המעטרים את קצות פלוס microtubule²¹. אלה מתחמי דינמי של פלוס-end מחייב חלבונים כוללים EB1, סרטון-170, אשר מתייחסים באופן קולקטיבי בתור microtubule פלוס-סוף מעקב חלבונים (+ טיפים)^21,22. + טיפים בקצות microtubules ניתן לאגד חלבונים המקושרים עם קרום פלזמה או את שלד התא אקטין קורטיקלית. זה מאפשר מנגנונים ליצירת כוח (למשלהמינוס-הסוף ביים תנועת מעוגן cortically דינאין לאורך microtubules) כדי להפעיל כוחות מושך-microtubules, ובכך למקם מחדש את MTOC. קליפ-170 ניתן לאגד החלבון אקטין-הקשורים פיגומים IQGAP1²³, הראינו כי שני חלבונים אלה נדרשים עבור MTOC BCR-induced קיטוב לכיוון ה¹⁷-סינפסה המערכת החיסונית. אינטראקציה זו IQGAP1-קליפ-170 עשוי לשחק תפקיד מפתח בתיאום את הבנייה מחדש של שלד התא אקטין עם מיקום מחדש של הרשת microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית B-cell.

קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופ חשף דרמטי לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך B-cell סינפסה המערכת החיסונית היווצרות². עם זאת, גישה זו אין אפשרות לפענח קטן מבנים הסלולר בפירוט עקב המגבלה עקיפה של אור, אשר, על פי החוק של אבה, היא תלויה אורך הגל של האור בשימוש כדי להאיר את הדגימה, את הצמצם של אובייקטיביות²⁴. מגבלה זו עקיפה מאלץ את הרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב, 500-700 nm, כיוון צירית²⁵. לכן, subcellular מבנים קטנים יותר, כמו גם את הפרטים הקטנים של אקטין, microtubule cytoskeletons, יכול רק להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה של שלד התא הוא זמן רב, דורש דגימה קשים קיבוע והכנות פרוטוקולים יכול לשנות מבנים ביולוגיים, ולא מוגבל לאיתור בתיווך נוגדנים. היכולת immunostain, בו זמנית תמונה מספר חלבונים או מבנים הסלולר הוא יתרון משמעותי של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, ביטוי פיוז’ן פלורסנט חלבונים בתאים מאפשר הדמיה בזמן אמת והוא שימושי כאשר נוגדנים יעילים עבור immunostaining החלבון עניין אינם זמינים.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות במיקרוסקופ ברזולוציה סופר יש להתגבר על המגבלות עקיפה של אור והתירו את החזיית ננו-מבנים הסלולר²⁴. אחד טכניקה מיקרוסקופית רזולוציה סופר כזה נקרא פליטה מאולצת מיקרוסקופ דלדול (STED). STED מעסיקה שני לייזרים, לייזר אחד מגרה את fluorophore ואיפה לייזר השני עם תבנית בצורת סופגנייה מעלימה באופן סלקטיבי את פליטת קרינה פלואורסצנטית סביב fluorophore. זה מפחית את פונקציית נקודת-התפשטות (אזור לכאורה) של חלקיק בודד פלורסנט ומספק^25,26תמונות פלורסנט מגבלת עקיפה המשנה. מיקרוסקופ דלדול הקרקע-המדינה מעסיקה גם טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית לרכוש תמונות ברזולוציה-העל. עם זאת, התמונה רכישה ושחזור הפעמים ארוכות ישנם רק מספר מוגבל של fluorophores יכול לשמש, ההדמיה ברזולוציה גבוהה בו זמנית של מספר רכיבים cytoskeletal הוא טכנית מאתגר כי שמירה אקטין ומבני microtubule דורש הליכים קיבוע שונות. לכן, STED יש מספר יתרונות על פני מיקרוסקופ אלקטרונים, אחרים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה גישות בכך שזה מציע ייבוא תמונות מהיר, יש דרישות מינימליות עיבוד דפוס, מעסיקה את fluorophores אותו והוא מכתים טכניקות זה משמשים פלורסצנטיות קונבנציונאלי מיקרוסקופיה של דגימות קבוע²⁶.

מיקרוסקופ ברזולוציה סופר עכשיו נעשה שימוש כדי להמחיש אקטין מבנים ב הסינפסה מחוסן טבעית תאים (NK) רוצח ו T תאים^{26,27,28,29,30, 31}. אולם, הדמיה ברזולוציה-העל של שלד התא microtubule, כמו גם מתואמת לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך היווצרות סינפסה המערכת החיסונית, רק באחרונה דווח על¹⁷. השתמשנו STED במיקרוסקופ בתאים תמונה B שלא היו נותנים למרוח אותו על coverslips מצופים נוגדן אנטי (anti-Ig) נוגדנים, BCR איתות וליזום רה-ארגון שלד התא. כאשר מצופה על קיבוע נוגדנים anti-Ig, בתאי B עוברים דרמטי תלויי-אקטין המריחה, אשר recapitulates את האירועים הראשונית במהלך היווצרות מערכת החיסון סינפסה. חשוב לציין, מיקרוסקופ STED חשף את הפרטים הקטנים של הטבעת דנדריטים של F-אקטין סינפסה צורות בפריפריה של מערכת החיסון, הראה כי את MTOC, כמו גם את microtubules המצורף אליו, עברה ליד האתר קשר אנטיגן¹⁷. אלה microtubules מורחב החוצה לכיוון הטבעת ההיקפית של F-אקטין. יתר על כן, ההדמיה STED צבע רב של שילובים שונים של F-אקטין, טובולין, IQGAP1, ו מתויג GFP קליפ-170 + טיפים הראתה כי microtubule פלוס-מסתיים בסימן קליפ-170-GFP היו קשורים באופן הדוק meshwork של אקטין היקפיים, עם IQGAP1, לכידת קורטיקלית חלבון¹⁷.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט הדמיה cytoskeletons אקטין, microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ STED. שיטות אלה מוטבו באמצעות קו תא B מאתר A20, אשר ננקטה נרחב ללמוד BCR איתות, סינפסה המערכת החיסונית היווצרות^{17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39}. בגלל נוגדנים מסחרי קליפ-170 לא פעלה היטב עבור immunostaining בניסויים הקודמים, נתאר בפירוט את הביטוי של מתויג GFP קליפ-170 בתאים A20, יחד עם צביעת פרוטוקולים להמחשת בו זמנית עד ל שלושה מרכיבים cytoskeletal או חלבונים הקשורים שלד התא. שיטות לשימוש STED מיקרוסקופ כדי התמונה אקטין-NK תאים חיסוניים הסינפסות היה שתואר לעיל⁴⁰. כאן, אנו להרחיב זה רכישת תמונות ברזולוציה סופר צבע רב של אקטין והן microtubule cytoskeletons בתאי B.

שיקול מכריע עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה היא באמצעות ההליכים קיבוע מתאים לשמירה על מבנים הסלולר ולמניעת נזק חלבונים פלורסנט. את הקיבעון, צביעת שיטות שהוצגו במסמך זה מוטבו שומרים על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP ולספק דימות ברזולוציה של הרשתות אקטין, microtubule. כאשר המבטאים חלבונים פלורסנט, יצוין כי בתאי B הם בדרך כלל קשה transfect. באמצעות פרוטוקול זה, 20-50% של A20 תאים בדרך כלל לבטא את חלבון כימרי transfected GFP, בקרב אוכלוסייה זו רמות החלבון הביטוי משתנה. למרות זאת, הדמיה ברזולוציה-העל של אקטין, microtubules באמצעות ההליכים שנתאר די חזקים, תמונות באיכות גבוהה מתקבלים בקלות. למרות גודלם הזעיר יחסית בתאים A20, אנו מראים כי הליכים אלה גם יכול לשמש כדי תמונה ברשת microtubule בתאי B הראשי הופעלו בקצרה עם ליפופוליסכריד (LPS). הראינו כי מופעל LPS בתאי B ראשי יכול להיות transfected עם siRNAs יעילות גבוהה יחסית (כלומר, כאלה כי חלבון דלדול ניתן להבחין באמצעות immunoblotting), גורמים להם אלטרנטיבה טובה לשימוש של שורות תאים B עבור מחקרים ¹⁷.