Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all’agente patogeno o danni associata – molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l’ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l’adesione del leucocita carenza¹. L’adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 1990^2,3. L’adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all’endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l’attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l’associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto⁴. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell’infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.

Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l’aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all’occlusione del vaso⁵. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un’arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all’interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l’ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione^6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (α_Mβ₂) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi⁸.

Data l’ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l’ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri⁹. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l’altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica¹⁰. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell’aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l’aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l’indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.