金小蜂金小蜂基因组操作的胚胎显微注射和移植技术

1. n 金小蜂菌落饲养 设置几个殖民地 (〜 3-5) 通过放置 200-500 N. 金小蜂成人 (与3:1 的女性: 男性的比例) 在臭虫宿舍笼子。注意: 除了使用臭虫宿舍以外, 黄蜂还可以在多个小玻璃试管中传播, 用棉花塞上大约15-20 黄蜂/瓶。 将黄蜂保持在25±1° c, 30% 相对湿度和12:12 光暗循环, 每天用小滴 1:10 (v/v) 蔗糖/水溶液喂养它们。注: 黄蜂的繁殖和收集也可以在室温下进行, 不受控制的湿度;然而, 低于25° c 的温度会略微降低胚胎的发育时间。 允许黄蜂交配至少4天前注射。 在头两天, 允许交配雌性饲料新鲜的bullata蛹, 以及小滴 1:10 (v/v) 蔗糖/水溶液。 在接下来的两天里, 去掉苍蝇蛹, 以剥夺雌性黄蜂的产卵场所, 使其非常妊娠。 2. n 金小蜂前胚阶段胚胎的收集和排列 允许雌性黄蜂寄生 (排卵胚胎) 进入年轻的寄主 (S. bullata蛹)。为了使主机保持新鲜, 在获得这些主机后立即将其存储在4° c 中, 并在需要时才删除。注意: 年轻的主机可以由红色的蛹, 而较旧的主机有一个较深的彩色蛹 (图 1A)。 将单个新鲜的bullata蛹放入一个具有 pupae-sized 孔切入中心的泡沫塞。只暴露〜0.2 厘米的前端 (首选产卵点) 的主机, 以最大浓度的寄生和更容易的胚胎收集。注意: 前端是圆的, 而后端较粗, 并包含一个 “火山口状” 开口 (图 1B)。 将寄主蛹 (大约每100只黄蜂的5寄主蛹) 放入笼中, 等待大约45分钟, 让黄蜂寄生它们 (图 2- ii)。注意: 非常重要的是, 胚胎是尽可能年轻的, 最好是在第一个小时的 oviposited, 以确保他们在 pre-blastoderm 阶段。不应注射陈旧的胚胎 (#62; 1.5 小时)。 通过手工检索和轻轻刷/吹掉任何居住的黄蜂, 删除寄生主机。每〜15分钟后, 更换新的主机, 以继续收集在注射期间早期阶段的鸡蛋。 用手从笼子里取出刚寄生的主机。在解剖显微镜下, 使用镊子, 仔细剥离外部蛹 (蛹壳) 的后端 (0.4 厘米), 以揭露N. 金小蜂卵 (图 2- iii)。注意: 必须小心避免穿刺蛹皮肤;如果发生这种情况, 血淋巴将滋润黄蜂的胚胎, 这将是非常难以去除的微注射。 使用液体粘合剂将片粘附在干净的玻片上, 以准备胚胎对齐幻灯片 (图 3)。注: 一种高性能的瞬时粘合剂用于提高粘结强度和干燥速度, 但是任何能使片在滑动中移动的胶水都是可以接受的。 小心地用湿细尖的画笔将胚胎从寄主中拒绝, 确保不损害寄主的软蛹皮肤。注: “胚镐”, 它实质上是一对超细镊子的一半, 可代替画笔使用。 转移〜20胚胎一个一个到幻灯片, 立即毗邻的片与湿画笔。将胚胎的前端朝向盖子滑动的边缘方向, 以便胚胎的后端指向相同 (图 2- iv)。这将使得在所有胚胎中注入相同位置的精确度更高。注: 此改进后的技术不需要双面粘胶带来修复与先前2122所描述的幻灯片有关的胚胎。此外, 不要枯萎胚胎, 或在注射过程中用烃油覆盖鸡蛋, 如前所述, N. 金小蜂胚微注射22。 3. Microinjections 针的制备 将硅酸铝毛细管玻璃放入针拔器中。注: 良好的针对于成功的金小蜂胚胎注射至关重要。注射针应该有一个尖锐的和细微的尖端, 以便通过绒毛膜容易穿透。还可以使用石英和硼硅酸盐毛细管 (图 4)。 将热设置为 605,速度到 130,延迟到 80,拉到 70, 以及压力至500针拔器。注: 在表 1中可以看到用于拉动石英和硼硅酸盐针的额外的拔针器设置;不同的车夫和细丝的参数可能有所不同。 激活拔针器以创建正确的针。根据需要重复生产多个针头。注: 拉针可以储存在一个培养皿中, 其中包含多个平行卷的商业建模者的粘土。 在25° c (图 2- iii) 上, 在十年代左右的时候, 将针尖与金刚石研磨板略微接触。注: 注射针头通过促进进入胚胎, 减少损伤, 同时提高了通过针流的董事, 从坡口受益。 4. 胚显微注射 准备由基因组修饰试剂组成的注射混合物 (例如,转 + 帮助剂转, 或 CRIPSR 试剂,等.), 并把它放在冰上。 使用 microloader 贴士, 用2µL 的注射剂装入注射针。注: 该协议中所示的注入混合物包括 single-guide RNA (sgRNA) 和重组 Cas9 蛋白混合在 H2O 中。 将带有内衬胚的玻璃玻片放在复合显微镜的舞台上。 小心地将针插入胚胎的后端, 垂直角度为25-35 °。注入 1-5 pL 注射混合物 (约2-10% 的胚胎的体积), 并确保胚胎似乎膨胀略有混合物注入到它 (图 2- iv)。注: 如果在胚胎中注入过多的注射混合物, 它可能会从胚胎中迸发出细胞质。此外, 不适当的斜面或折断的针头太大的开放也可能导致胚胎破裂。 如果发生堵塞, 尝试 re-beveling 针。金小蜂胚的细胞质异常黏稠, 粘稠, 导致频繁的针头堵塞 (1/25 注射)。注意: 重要的是要保持在注射期间的胚胎湿润, 定期添加去水使用画笔。在刷子上的水的数量是关键的移动胚胎周围和协调与轻松。过多的水导致胚胎漂浮, 过少的水使它们很难四处走动。 一次注射〜20-40 鸡蛋 (应采取约10分钟), 然后停止。通过轻轻地接触注射过的鸡蛋并将它们放入寄主中, 将注入的鸡蛋与湿的画笔一起转移。然后继续使用新鲜的新产卵的一批鸡蛋 (和 #62, 1 岁) 再次注射。注意: 理想情况下, 如果一个人不断地收集和排列鸡蛋, 而另一个人在注射基因组修饰成分和移植胚胎到寄主蛹, 这个协议是最有效的。 5. 将G0 金小蜂胚胎移植到前蛰寄主上 小心地将注入的 G0胚胎放在先前被蜇过的bullata蛹 (图 2- vi) 上, 并在注射后用湿的画笔。注: 用于收集用于显微注射的胚胎的寄主蛹将为此目的而工作。此外, 尽管有很大的努力, 目前还没有可用于22的人工饮食。 在一个单一的 pre-stung 寄主上放置多达40次注射的胚胎, 以避免过度拥挤和幼虫的竞争。注: 注射会对胚胎造成损害;不小心移植胚胎的寄主蛹可能挤压注射成分或蛋黄, 并导致死亡的胚胎。 将寄主蛹放入带有湿滤纸和棉球的培养皿中, 在25° c 下孵育, 大约70% 的湿度, 直到注入胚胎孵化 (大约1-2 天) (图 2- vii)。注意: 重要的是, 主机可以留有去皮关闭蛹和N. 金小蜂鸡蛋将发展正常, 只要他们在一个湿润的会议厅 (培养皿湿滤纸和棉花球), 以防止干燥。在室温下孵化, 从被挫伤的棉球中湿度是足够的, 以防湿度无法控制。 在 G0胚胎孵化后, 将寄主蛹转移到70% 湿度和 25°C 的新的培养皿中。 每日监测寄主蛹并注入 G0幼虫。如果寄主蛹有臭味, 将注入的幼虫转移到新的健康寄主蛹。 6. 基因组修饰的筛选 使用精美的画笔或胚镐从主机上移除每个金小蜂蛹。注入 G0幼虫应在注射后蛹8天左右。 将每个被移除的蛹放入一个与棉花连接的隔离玻璃瓶中, 让它们成为 G0成人, 以确保孵出的雌性将会成为有助于下游遗传杂交的处女。注: 雌性可以从男性的翅膀长度: 女性有较长的翅膀, 延伸过去的身体轮廓时, 转向一侧。所有的微量雌性蛹可以放在一起插入一个小瓶, 同样适用于雄性蛹。 屏幕 G0个体, 在羽化之后, 通过 PCR 或视觉 (如果扰乱了表型基因)。例如, 如果 CRISPR 用于在给定的基因中创建删除, 而被破坏的基因则赋予一个可见的表型, 然后将个体与受影响的表型 (图 2- viii)21的变种版本进行排序和保持。然而, 如果受影响的基因编码的不表型, 如一个基本基因突变体, 执行交叉方案 (交叉 g0男性与野生型女性, 或交叉 g0女性与野生型男性) 恢复和屏幕可遗传的突变体通过测定致死或不育。注: 与四腹果蝇类似, N. 金小蜂成人可通过暴露于 CO2来固定, 允许直接操作。此外, 交配雌性会产生100% 单倍体雄性巢, 因此突变的交配雌性可以产生大量的突变雄性, 可用于随后的分析。注意: 必需基因突变将需要通过交配存活的 G0注入雌性 (想必是杂突变) 保存到野生型雄性;在这个特殊情况下, 一半的 g1的雄性后代应死亡, 由于遗传的致命突变, 而一半的 g1雌性后代将是致命的载体。 Outcross g0成人和屏幕 g1后代的转基因插入使用转基因标记, 如果目标是转基因。当前转基因仍有待在N. 金小蜂中演示。