Otomatik hizalama ve substrat imalat hücre kültür araştırmaları için uygulama tarafından kolaylaştırdı geniş alan tarama prob Nanolithography

1. PPL kalem dizi imalatı Polydimethylsiloxane (PDMS) kopolimer karışım hazırlamak için: Platin (0) – 1,3 – 10 µL eklemek divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane kompleksi çözüm ve 172 µL 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane 250 gr (7-%8 w/w vinylmethylsiloxane) için-dimethylsiloxane kopolimer. Bu bileşenleri homojen karıştırma sağlamak 7 gün döner bir mikser üzerinde iyice karıştırın.Dikkat: Platin (0) – 1,3 – divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane zehirli. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. (% 25-35 w/w methylhydrosiloxane) 0.5 g ekleyin-dimethylsiloxane kopolimer karışımı bir 1,7 g bölümüne bir tartı adım 1.1.1 gelen tekne ve iyice bir spatula ile karıştırın. Bu karışımı bir vakum desiccator aktarma ve gaz kabarcıkları dağılmış kadar 20 min için düşük basınç (200 mTorr, 0.3 mBar) karışıma açığa degas. Bir plastik şişe vida tepesinde bir 13 x 13 mm cam slayt 20 mL 2-propanol ile dolu yer sonra şişe için herhangi bir büyük enkaz kaldırmak 10 dk ultrasonik bir banyo yer. Slaytları taze 2-propanol (100 mL) slaytları batış tarafından Yıkayıp kurulayın azot gazı akışı altında. Bir silikon kalıp18 4 cm çapında petri kabına yerleştirin ve yeterli degassed PDMS prepolimer karışımı (Kimden adım 1.1) kadar tamamen kaplı ekleyin. Tipik olarak, 100 µL için bir 20 x 20 mm ana gereklidir. Asıl prepolimer karışımı ile bir vakum dessicator yerleştirin. Polimer karışım aktarım sırasında oluşan herhangi bir gaz kabarcıkları kaldırmak başka bir 5 min için degas. Gaz giderme yer alıyor iken cam slaytlar (adım 1.4 aşağıda) O2 plazma tedavisi yapılmalıdır. En fazla RF Güç her türlü organik kirlilik ve elastomer yapışma için bardak üzerinde bir üniforma oksit tabaka üretmek için 1 dk için cam kareler O2 plazma (600 mTorr) ile tedavi. 19 kullanımı plazma slaytlar hemen sonraki adımda tedavi. Dikkatle kare cam slayt (Kimden adım 1.4) asıl (Kimden adım 1.3) prepolymer plazma temiz yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Yavaşça silikon asıl üzerine cam kaymak aşağı herhangi bir kapana kısılmış havayı çıkarmak için ve PDMS Tekdüzen bir filmin asıl ve slayt arasında sandviç olduğunu emin olmak için basın. Yer gözükeceksin PDMS dizi silikon ile bir petri içinde adım yukarıda altındaki (yani, yukarı bakacak şekilde cam slayt arkası ile) ana ve 70−80 ° C 24−48 h PDMS termal tedavi etmek için bir fırın çanak yerleştirin. Tedavi dizi Fırından çıkarın ve izin için serin 15 dakika sonra bir tıraş bıçağı ile dikkatli bir şekilde herhangi bir aşırı PDMS arkasından çıkarın ve yan cam slayt ve herhangi bir gevşek PDMS enkaz öldürmeyi kuru azot akışı kullanın.Not: sıfırdan tıraş bıçağı ile silikon master Bu yapışmaz kaplama zarar verebilir özen. Bir jilet 1 mm derinlikte dizinin köşeye kama ve dikkatle master dışında dizi Gözetlemek. Bu eylemi tek bir sürekli kaldırma eylemi gerçekleştirme; Asıl düşmeye diziler izin vermez. Dikkatle kesin ve uzak bir tıraş bıçağı ile dizinin kenarlarda 0,5 mm PDMS kazımak. Herhangi bir gevşek PDMS enkaz öldürmeyi kuru azot akışı kullanın.Not: Bu düzeltme adımı stereoscope veya büyüteç altında gerçekleştirmek daha kolay olabilir. Çizik tıraş bıçağı ile silikon master Bu yapışmaz kaplama zarar verebilir özen. 2. dizi hazırlık ve yüzey montaj Sonda dizi hidrofilik yüzeyinde O2 plazma tarafından tedavi oluşturmak: Yer plazma odası bir petri kabına PPL kalem dizide için 600 mTorr vakum uygula. 30 plazma jeneratörü (maksimum ayar) geçiş s. Vakum yayın, dizi kaldırmak ve onun hydrophilicity dizinin üzerine deiyonize su 20 µL silmek ve hatta su yüzeyi boyunca yayılan olup gözlemleyerek kontrol edin. Bu gerçekleşmezse, dizi plazma tedavisinin ikinci tur için tabi. Daha sonra dizi kuru azot gazı akışı ile iyice kuru. Karbon çift taraflı bant kullanarak dizi orta sonda sahibinin üzerine ekleyin. Sonda tutucu AFM kinematik tutucu (Şekil 2) üzerine monte. 16-mercaptohexadecanoic asit (MHA) (‘mürekkep’) içeren PPL dizi yüklemek için: 8.6 mg 30 mL etanol bir tüp içinde eriterek, bileşik tamamen erimeye 10 dk ultrasonik bir banyo yerleştirerek 1 mM 16-mercaptohexadecanoic asit (MHA) çözüm hazırlamak.Dikkat: 16-mercaptohexadecanoic asit zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. Bir micropipette, mevduat 20 µL damla MHA çözüm üzerinde kullanarak. Pipet ipuçları dizileri ile temastan kaçının. Dizi yayılmış, sonra ortam koşulları altında buharlaşır etanol olanak sağlar.Not: hizalama yerini almıştır sonra PPL dizi alternatif olarak Inked. 10 MHA çözüm kuruduktan sonra sonda sahibi PPL dizi üzerine AFM ile bağlayın. 3. altın yüzeylerde hazırlanması için PPL. Altın yüzeylerde satın veya termal veya elektron içi yaptığı ışınla ifade ve 2 nm titanyum yapışma katmanın 20 tarafından takip inşa nm altın cam veya silikon gofret üzerinde. 18 Gerekli hallerde, yüzeylerde oksijen plazma tedavi 1.4 adımda açıklanan parametreleri kullanarak temizleyin. Altın substrat AFM örnek sahne ortasında yer ve belgili tanımlık substrate (Şekil 2) sınırları çevresinde yapışkan bant ile güvenli. Sahne Alanı’na doğru yüksekliği zkullanarak üreticinin işletim talimatlarını belirtildiği şekilde ayarlamak-eksen denetleyicisi. 4. otomatik kalem dizi hizalaması Açık ve sahne alanı denetleyicisi Kur programı (SetupNSF.exe) (‘sıfır’) tüm eksenlerde sıfırlamak için bilgisayarda çalıştırın ve önceden ayarlanmış için sıfır noktasını açılar o zaman kullanılacak sahne x/y-eksen denetleyicisi konsol için istediğiniz hizalama substrat taşımak için / yazdırma konumu. En iyi sonuçlar için belgili tanımlık substrate sahne, sahne alanı’nın kuvvet sensörleri arasındaki merkezine yakın yerleştirilmelidir.Not: modellerinde birkaç bilgisayarının, x/y-eksen denetleyicisi USB sinyal müdahale bununla z-eksen denetleyicisi. Bu durumda, xkesmek /y-eksen denetleyicisi USB kablosu Bu adımdan sonra. Sonra hizalama yordamı (adım 4.7) sonra yeniden. Sahne serbest bırakma kolunu örnek sahne serbest bırakmak ve kuvvet sensörleri triad AFM üretici yönergelerine tarafından belirtildiği şekilde harekete geçirmek için geçiş. En az 15 dakikadır equilibrate kuvvet sensörleri izin. En iyi sonuçlar için 30-50 dk izin. Görsel olarak sonda dizi ve yüzey gözlemleyerek yakınlığı ile belgili tanımlık substrate dizi getirmek için z ekseni yüksekliğini artırın.Not: Yakın dizi yüzeye, az yineleme böylece zamandan tasarruf hizalama işlemi için gereklidir. Otomatik hizalama programı (otomatik olarak hizalama v16.exe) Aç/Çalıştır ve programa ilgili hizalama parametreleri girin. İstenen ‘açı adım’ parametre değeri, genellikle 0.15° girin. Bu parametre program tarafından belirlenir her eksen için ‘en uygun’ açıdan mahsup açıdır. Açıları bu aralıktan daha alt açıkça tespit gücü fark sondalar yaklaşımı üzerine yüzeye neden değil gibi 0,1 ve 0.2 ° arasında bu parametreyi ayarlayın.Not: Yazılım millidegrees değerleri kabul eder (yani, 1 x 10-3 °). Örneğin, 0.15 ° için kullanıcılar ‘150.’ giriş İstenen kaba adım girme ‘ parametre değeri, genellikle 0.6 µm. Bu parametre ilk kaba uyum içinde probları yaklaşırken sahne tarafından kullanılan z ekseni adım boyutudur. 0,2 arasında bu parametreyi ayarlayın ve 1 µm. daha büyük boyutları azalma hizalama işlemi için geçen süre adım ama hizalamayı doğruluğunu azaltmak ve sondalar aşınma artırmak.Not: Yazılım mikrometre kaba adımda değerleri kabul eder. Örneğin, 0.6 µm ‘0,6’ kullanıcılar giriş. İstenen ‘İyi adım’ parametre değeri, genellikle 0.2 µm girin. Bu parametre en uygun hizalama ince ayar için kullanılan z ekseni adım boyutudur. Çoğu uygulama için 0,1 arasında bu parametreyi ayarlayın ve 0.4 µm. daha büyük değer adım boyutları için hizalama işlemi gerçekleştirilen süreyi azaltmak ancak hizalamayı kalitesini azaltır.Not: Yazılım iyi mikrometre adımda değerleri kabul eder. Örneğin, 0.2 µm için kullanıcılar ‘0,2.’ giriş ‘Excel dosya yolu’ yapılandırmak ve ‘klasör’ simgesini kullanarak, dosya konumuna gezinme ve “OK” tuşuna basarak sağlanan elektronik tablo şablonu dosyası değiştirilmemiş bir kopyasını iliştir. Bu dosya sahne alanı optimum sahne tilt açılarını belirlemek için kullanılan ham ve hesaplanan veri içerir. Aç/Çalıştır AFM kontrol yazılımı. (Göre üretici yönergelerine) ‘spektroskopisi’ düğmesini tıklatarak bu programı spektroskopisi bileşenine gidin ve 10 µm den fazla 100 ms 250 ms, bir duraklama süresi ile tarafından sonra salınım 10 µm 100 ms geri çekmek için için AFM tarama baş z ekseni ayarlayın ile bir duraklama süresini 250 MS (Şekil 3). AFM kafa salınan otomatik hizalama işlemine başlamak için hizalama yazılım ‘Başlat’ düğmesini tıklatın. Program çalışırken yazılım yazma ve 4.4.4. adımda anlatılan dosya veri okuma.Not: Hizalama 30 dk ve 4.4 adımda girilen adım 4.3 ve yazılım yapılandırma kümesindeki ilk aşamada pozisyona bağlı olarak 3 h arasında olur.Dikkat: Sahne alanı denetleyicisi konsolları hizalama işlemi sırasında halen etkin olan – hizalama ile müdahale edecek gibi onları hizalama işlemi sırasında kullanmayın. Hizalama tamamlandığında yaktı hizalama yazılım (Kimden adım 4.4) yeşil ışık kutusunu ‘Hizalama tamamlandı’. Bu durumda, hizalama işlemi sonlandırmak için Kullanıcı arabiriminde ‘STOP’ düğmesini tıklatın. Yazılım tarafından oluşturulan grafikler elektronik tablo şablonu dosyasında kaydedilen veri noktaları ve uygun satır arasında bir ilişki için kontrol edin. Tipik R2 değerleri > 0,99 ile iyi bir ilişki, örnekler için temsilcisi sonuçları görmek. Hizalama başarısız olursa, soruşturma dizi yeni hazırlanan bir dizi (adım 2) ile değiştirin ve (adım 4.4) hizalamayı yinelemek. Sahne alanı yukarı taşımak içinde z-ekseni o eksen için sahne alanı denetleyicisi konsolunu kullanarak. İlgili kişi AFM üstten görünüm kameradan görülebilir kadar sahne alanı 500 nm aralıklarla taşınması gereken. Dizi ve substrat arasında iletişim bireysel sonda piramitler, tepe, yüksek karşıtlık bir ‘beyaz nokta’ olarak görülmektedir. Bu noktada, adım 4.5 gelen spektroskopisi programını durdurmak için AFM kontrol yazılımı ‘stop’ butonuna tıklayın. Bu dizi bu nedenle olası z ekseni uzantısı 10 µm bırakarak 10 µm tarafından geri çekmek. AFM probları ile temas substrat değildir sağlamak için en iyi görüş kamerası görüntüden denetleyin. 5. polimer kalem litografi (PPL) Kontrol yazılımı ‘litografi’ butonuna basarak kontrol yazılımı litografi bileşenine gidin. Zseçin-modülasyon işletim modu ve bir raster (bitmap) alma veya vektör litografi desen olarak kullanılacak görüntü. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen özellikleri oluşturmak için bir kılavuz PPL diziyi sondanın başına 20 x 20 nokta litografi karşılık gelen (bkz. ek malzeme) 20 x 20 siyah piksel, oluşan bit eşlem kullanın. Litografi parametreleri AFM denetleyicisi yazılım “Pixel grafik al” penceresine girin. ‘Boyut’ var olmak oluşturmak için desen, Örneğin, 40 µm uzunluk ve genişlik yapılandırın. Bu parametreler genişlik ve uzunluk üzerinde bit eşlem görüntü ölçeklenir gösterir. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen özellikleri oluşturmak için her iki boyutlu olarak bir genişliği ve uzunluğu 40 µm kullanın. ’25 µm x ve y ekseni üzerinde oluşturulacak kökeni’ desen ayarlayın. Bu parametreler AFM xortasına göre resmin merkezine belirlemek /y-eksen. Sondalar hizalama işlemi sırasında temas halinde olduğu bölge yüzeyi önlemek için bu parametreler ayarlayın. ‘Parameters’ baskı ayarlayın. Bu değerler sondalar (yani temas yüzeyi getirdi) genişletilmiş şeklini belirler bit eşlem resimdeki her piksele karşılık olarak. Damla-aşağı yemek listesi ‘Modülasyon Abs Z Pos’ ve ‘Basitleştirin için’ iki katmanı seçin. Bu mod yalnızca iki sonuçları, ‘kara (0)’ ya da ‘Beyaz (1)’ alanları tarafından belirlenen mutlak bir mesafeye göre probları genişletmek için AFM bildirir. ‘Siyah (0)’ ve ‘Beyaz (1)’ alanlarındaki değerleri sırasıyla 5 ve -5 µm için ayarlayın. Bu değerler sondalar taşınabilir yanıt olarak bir siyah ya da beyaz piksel bitmap görüntüde mesafeyi belirlemek ve genellikle ‘Black’ için 3 ile 5 µm arasında set (yani, sondalar o eksen sıfır noktasına göreli olarak o mesafeye göre aşağı doğru uzatmak) ve -3-5 µm ‘Beyaz’ için için (yani, sondalar tarafından 3-5 µm sıfır noktasına göreli olarak yukarı doğru çekilme).Not: 5 mikron uzantısı yüzeyi ile temas geliyor probları sonuçlanan temsilcisi bu mesafeleri varsayalım ve bu nedenle 5 mikron çekilme probları yüzey uzak asansörleri iken bir özellik nesil kaynaklanan hiçbir temas halinde. Z-uzantısı daha büyük şekil içinde kaynaklanan yüzey içine daha fazla basýlmasýný probları yüzey, büyük uzantıları sonucu sonda kişiyle ölçüde belirleyerek özellik boyutu etkiler. 10 Bu ayarları uygulayabilir ve pencereyi kapatmak için ‘OK’ butonuna tıklayın. ‘Duraklama süresini’ AFM kontrol yazılımı, genellikle 1 litografi penceresine girin s. Bu ayarı 0.1 ila 10 s arasında genellikle ayarlanmış Genişletilmiş ‘Black’ pozisyonda sondalar kalır süreyi belirler.Not: Altın yüzeye taşınan MHA daha büyük miktarda nedeniyle büyük özelliği boyutlarda uzun duraklama süreleri yol. Başka raporlarda oluşturulan özellikleri boyutunu denetleme üzerinde daha fazla bilgi bulunabilir. 20 Atmosferik denetim muhafaza hazırlayın. Atmosferik İzolasyon Odası AFM üzerine alt ve Aç/Çalıştır atmosferik kontrol üreticisi tarafından sağlanan yazılımı (MHG_control.exe). Bağıl nem oranı % 45, sıcaklığı 25 ° C ve bir atmosfer Döviz korumak için atmosferik kontrol yazılımı ‘500 mL yazılım içerisinde bu değerleri girerek debi’ ayarlayın. ‘Ayarları uygulamak için kullan’ seçeneğini tıklatın. Atmosferik kontrol modülü sonra odanın içine oksijen hava pompası başlayacak.Not: Yüksek nem düzeyleri kalem diziler ve yüzey arasında oluşturulan daha büyük bir su menisküs oluşumu nedeniyle büyük özelliği boyutlarda sonuçlanır. 21 bu değer genellikle 40 ile % 60 arasında ayarlanabilir. Akış hızı genellikle 300 ve 500 mL arasında ayarlanabilir. Daha büyük akışı daha hızlı ulaşmak istenen nem seviyesi sağlar ancak daha az doğru. Temsilcisi sonuçları bir akış hızı 500 ml nem oranı ilk üretimi için kullanın ve litografi sırasında doğru ve kararlı bir düzeyde tutmak için istenen nem ulaşan üzerine 300 ml azalır. İstenilen nemi alındıktan sonra taş sıra yazılım arabiriminde ‘Başlat’ düğmesini tıklatarak başlatın. Litografi tamamlandığında, z ekseni sahne alanı denetleyicisi konsol tarafından 500 µm sahne çekiyoruz tarafından dizi uzak substrat taşımak için kullanın. Atmosferik izolasyon odası onun Dağı kaldır. AFM üretici yönergelerine tarafından belirtildiği şekilde örnek sahne kilitlemek ve kuvvet sensörleri devre dışı bırakmak için sahne serbest bırakma kolunu geçin ve substrat sahne alanı’ndan kaldırın. 6. desen görselleştirme Desen aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak görüntülenir, tarama prob mikroskobu ya da kimyasal aşındırma gücü lateral. AFM desenli yüzeye erişerek özelliklerini incelemek için iletişim modu konsol kullanarak yanal kuvvet moduyla inceden inceye gözden geçirmek.Not: Lateral kuvvet mikroskobu görüntüleme özellikleri polimer kalem litografi tarafından üretilen zararsız bir yöntem olarak kullanılabilir; Ancak, bu yöntemi kullanarak, yalnızca göreceli olarak küçük bir alanı görüntülenmeyecektir (genellikle 100 x 100 µm) olabilir. Yatırılan MHA etch resist hareket edebilir, kimyasal aşındırma altın desenli sigara alanlarından kaldırmak için kullanılabilir. Elde edilen unetched alanlarda sonra geniş bir alan-ebilmek var olmak görüş aynı anda anlam optik mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir. 18Not: Bu şekilde kazınmış yüzeylerde daha sonra aşağıda açıklanan sonraki hücre kültürü deneyleri için kullanılamaz. Ayrı ayrı, 40 mM Tioüre, 27 mM demir(III) nitrat ve 100 mM hidroklorik asit sulu çözümler hazırlamak. Etchant 5 mL her üç bu çözümlerin de karıştırarak hazırlayın. Taze her kullanımdan önce karıştırın. 22Dikkat: Tioüre, demir(III) nitrat ve hidroklorik asit zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. Desenli yüzey bir petri kabına ve pipet yeterli etchant çözüm substrat (genellikle 10 mL) yüzeyi kapsayacak şekilde çanak içine içine aktarın. 4-5 min için 15 etch batık substrat tutmak nm altın (bir oranda yaklaşık 3 nm/dk). Gravür tamamlandığında, substrat kaldırmak ve su ile iyice durulayın ve azot bir akışı ile kuru.Not: işlem aşındırma tamamlanması gravür oranı (adım 6.2.2) belirtilen ilişkili elde edilen altın yüzey (adım 3.1) kalınlığını belirler. Parlak alan optik mikroskobu altında kazınmış altın özellikleri inceleyin. Kalır kalan altın özellikleri (adımından 5.2) Yazdırılan desene karşılık gelen görüntülenmesi gerekir. Tüm yüzey homojen görünürse, bu altın önemli miktarda kalır ve gravür adım (aşağıdaki adım 6.2.2) 1-2 min için yinelenmelidir gösterir. 7. desen functionalization fibronektin ile Desenli yüzeyler için 1 h. yıkama substrat Etanol Etanol ile üç kez 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) çözümde bir çözüm içine sokmak ve azot akışı altında iyice kurulayın. Bu adımı unpatterned altın alanlar passivates.Dikkat: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. 10 mm 5 min için Co (NO3)2 sulu çözüm yüzeylerde daldırın. Ardından, çözüm, üç kez Ultrasaf Su ile yıkama ve kuru azot akışı altında kuru yüzeylerde kaldırın.Dikkat: Co (NO3)2 zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. Fibronektin fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde bir 50 µg/mL çözüm substrat bırakın ve 16 h. yıkama substrat üç kez ile PBS için 4 ° C’de kuluçkaya sonra kuru bir dere kuru azot altında belgili tanımlık substrate.Not: Fibronektin Co(II) şelasyon MHA functionalized alanlarına terminal karboksilik asit grubu tarafından MHA üzerinde bağlıdır. Fibronektin ardından Co(II) üzerinden için kendi kollajen bağlayıcı etki bağlar. 23 İstenirse, yüzey bağlı fibronektin ile floresan antikor etiketleme tarafından görselleştirin: 1: 100 çekimsiz tavşan anti-fibronektin birincil antikor PBS Sığır serum albumin (BSA) (w/v) % 5, 2 mL solüsyon yüzeye uygulamak ve 16 h. aspiratı süpernatant için 4 ° C’de kuluçkaya ve üç kez PBS ile yıkayın. 2 mL solüsyon fluorescently konjuge anti-tavşan ikincil antikor (, üreticinin belirtilen seyreltme, 2 damla/mL) % 5 (w/v) PBS BSA, substrat daldırın, kapak kalay folyo ve 1 h. aspiratı için oda sıcaklığında kuluçkaya süpernatant ve üç kez PBS ile yıkayın. Kayıt epifluorescence mikroskobu görüntüler üreticinin yönergeleri doğrultusunda floresan mikroskop ile bir uyarma filtresini kullanarak özellikleri 594 için ayarlamak nm. 8. hücre kültürü nanofabricated yüzeylerde 4inci ve 6inci geçit arasında iyi karakterize hMSCs süspansiyon hazırlamak. 24 Hücre konfluent bir şişesi bir kez 10 mL PBS ile durulama tarafından askıya alma, yapıştırılan hücrelerin T75 doku kültürü şişesi 5 mL tripsin/EDTA de ekleyerek ayırmak ve oksijen odası için 5 dakikaya kadar % 5 CO2 ile % 90 o kadar takıma 37 ° C’de şişeye kuluçkaya f hücre yüzeyinden ayrılır. Daha sonra 6 mL taze kültür balonun % 10 fetal buzağı serum (FCS) içeren medya ekleyin ve kısa bir süre şişeye eklendi Medya ile durulayın. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü ve 5 min için 400 g 25 ° c de santrifüj içine aktarın. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 3 mL taze kültür ortamının resuspend. Hemasitometre25 kullanarak hücre yoğunluğu saymak ve buna ek olarak kültür ortamının uygun bir birimi tarafından hücre süspansiyon 2 x 104 hücre/ml yoğunluğunu ayarlayın. Tohum hücreleri yüzeylerde 104 hücreleri/cm2yoğunluğu, üzerine. 1 x 1 cm2 elmas scribe ile belgili tanımlık substrate oyulmuş ve 12-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda yerleştirebilirsiniz. Hücre süspansiyon kültürü medya (Kimden adım 8.1.4) 2 mL kuyuya pipet ve 24 saat için % 5 CO2 ile takıma 37 ° C’de oksijen odasında kuluçkaya. Desenleri hücre büyümesini sonra hücre eki ve ayirt tarafından yayılan ölçüde çözümleyin: Medyayı çıkarın ve yüzeylerde kez PBS ile yıkayın. Hücreler 2 mL lik PBS (37 ° C için önceden ısındı) %4 paraformaldehyde ile duman hood ve yıkama üç kez PBS ile 20 dk fix.Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir. MSDS bu çözüm ile çalışmaya başlamadan önce okuyun. Güvenlik ekipmanları kimyasal taşıma sırasında takılmalıdır. 2 mL lik % 0.5 deterjan hücrelerle permeabilize ( Tablo malzemelerigörmek) 15dk için PBS içinde sonra üç kez PBS ile yıkayın.. 1: 0 5 (w/v) BSA PBS ile seyreltme, çekimsiz tavşan anti-fibronektin birincil antikor lik 2 ml substrat daldırın ve 16 h için 4 ° C’de kuluçkaya sonra %0.1 (v/v) ara 20 PBS (PBST) üç kere yıkayın. Daha sonra fluorescently konjuge anti-tavşan ikincil antikor (%5 (w/v) BSA PBS, üreticinin belirtilen seyreltme, 2 damla/mL ile seyreltilmiş) lik 2 ml substrat daldırın, kalay folyo kapak ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya, sonra üç kez %0,1 ile yıkayın PBST. Aktin filamentleri etiketlemek için PBS 1:250 seyreltme, fluorescently konjuge phalloidin 2 mL daldırın, kalay folyo kapatın ve 30 dk için 4 ° C’de kuluçkaya sonra üç kez PBS ile yıkayın. Aynı anda hücre çekirdeği leke ve substrat orta içeren DAPI ve bir coverslip ile kapak montaj bir damla uygulayarak monte edin. Hücrelerin uyarma 365 filtreleriyle üreticinin yönergeleri doğrultusunda floresan mikroskop kullanarak görselleştirmek için çekirdek (DAPI), 488 nm nm F-aktin ve 594 nm fibronektin için.