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生物工程

Grande área varredura sonda Nanolitografia facilitada pelo alinhamento automatizado e sua aplicação para fabricação de substrato para estudos de cultura celular

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/56967
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1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry,University of Manchester, 2School of Engineering,University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering,University of Manchester, 4School of Science and Technology,Nottingham Trent University

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para área ampla varredura sonda Nanolitografia habilitado pelo alinhamento iterativo de matrizes de sonda, bem como a utilização de padrões de litografia para estudos de interação da pilha-superfície.

Abstract

Sonda de microscopia permitiu a criação de uma variedade de métodos para a fabricação de cima para baixo (‘aditivo’) construtiva das características de escala nanométrica. Historicamente, uma grande desvantagem de varredura de sonda litografia foi a intrinsecamente baixa taxa de transferência de sistemas da sonda única. Isto já foi abordado pelo uso de matrizes de várias sondas para habilitar Nanolitografia maior taxa de transferência. Para implementar tal Nanolitografia em paralelo, o alinhamento preciso de matrizes de sonda com a superfície do substrato é vital, para que todas as sondas fazem contato com a superfície simultaneamente quando padronização litográfica começa. Este protocolo descreve a utilização de litografia de caneta de polímero para produzir características da escala nanométrica sobre áreas centímetro de tamanho, facilitadas pelo uso de um algoritmo para o alinhamento rápido, preciso e automatizado de matrizes de sonda. Aqui, Nanolitografia de tióis em substratos de ouro demonstra a geração de recursos com alta uniformidade. Esses padrões são então acrescidos com fibronectina para uso no contexto dos estudos de morfologia de células de superfície-dirigido.

Introduction

Progresso em nanotecnologia é dependente do desenvolvimento de técnicas capazes de nanoescala características em superfícies de fabricação eficiente e confiável. 1 , 2 no entanto, gerar tal apresenta-se em grandes áreas (vários cm2) confiável e no custo relativamente baixo é uma tarefa não trivial. A maioria das técnicas existentes, derivada da indústria de semicondutores, dependem de fotolitografia ablativa para fabricar materiais ‘duras’. Mais recentemente, técnicas litográficas derivadas de microscopia de sonda (SPM) surgiram como uma abordagem conveniente e versátil para a prototipagem rápida de projetos de escala nanométrica. 3 técnicas baseadas em SPM são convenientemente e rapidamente ‘ escrever ‘ qualquer padrão definido pelo usuário. O mais conhecido destes é Nanolitografia dip-pen (DPN), pioneira por Mirkin et al.4 , onde uma sonda de varredura é usada como uma ‘caneta’ para transferir uma ‘tinta’ molecular para a superfície, produzindo características de uma forma análoga à escrita. Em condições ambientes, como uma sonda é verificada através de uma superfície as moléculas ‘tinta’ são transferidas para a superfície através de um menisco de água que se forma entre a sonda e a superfície (Figura 1). DPN permite, assim, a deposição de nanolithographic de uma vasta gama de materiais, incluindo materiais ‘suaves’, tais como polímeros e biomoléculas. 5 técnicas relacionadas usando sondas projetadas com canais para entrega fluida, diversas vezes referido como ‘nanopipettes’ e ‘nano-canetas-tinteiro’, também foram relatados. 6 , 7 , 8

O principal obstáculo para uma aplicação mais ampla da litografia SPM-derivado é a taxa de transferência, que requer um tempo excessivamente longo para áreas de centímetro-escala padrão com um único teste. Os primeiros esforços para abordar esta questão enfoca a paralelização de DPN baseada em cantilever, com ‘one-dimensional’ e ‘bidimensional’ matrizes de sonda (2D), sendo relatados para a litografia de áreas centímetro de tamanho. 5 , 9 no entanto, esses conjuntos de cantilever são produzidos através de métodos de fabricação relativamente complexa de várias etapas e são relativamente frágil. A invenção da litografia de caneta de polímero (PPL) abordou essa questão, substituindo os padrão SPM cantilevers com uma matriz 2D de sondas de elastômero macio siloxano ligada a uma lâmina de vidro. 10 esta configuração simples sonda diminui significativamente o custo e a complexidade de padronização de grandes áreas, abrindo Nanolitografia para uma ampla gama de aplicações. Essa arquitetura livre do cantilever também foi ampliada para duro-ponta macia-Primavera litografia,11 , que fornece um híbrido de apoio elastomérico macio com pontas de silicone duro dando resolução melhorada em comparação com os padrões produzidos utilizando macio Dicas de elastômero.

Um fator crucial na execução destas tecnologias matriz 2D é que a matriz da sonda deve ser exatamente paralela ao substrato de superfície para que quando é utilizada a litografia, todas as sondas entram em contacto com a superfície simultaneamente. Mesmo um pequeno desalinhamento pode causar uma grande diferença no tamanho do recurso de um lado da matriz para o outro, desde que algumas sondas virá em contacto com a superfície anterior durante a descida da matriz, enquanto outros entrarão em contato mais tarde ou não em todos. 12 alinhamento exato é especialmente importante com PPL devido a deformabilidade das sondas elastômero macio, onde as sondas entrar em contato com a superfície anterior serão compactadas, deixando uma pegada maior na superfície.

Os primeiros trabalhos na PPL empregado inspeção puramente visual para orientar o processo de alinhamento, usando uma câmera montada acima da matriz para observar a deformação das sondas piramidais, como eles foram postos em contacto com a superfície. 10 alinhamento foi julgado por observar de que lado das sondas entrou em contato com a superfície primeiro, em seguida, ajustar o ângulo e repetindo o procedimento de forma iterativa, até que a diferença de contato de cada lado da sonda foi indistinguíveis a olho. Como este procedimento de alinhamento baseia-se na inspeção visual subjetiva pelo operador, a reprodutibilidade é baixa.

Posteriormente, foi desenvolvida uma abordagem mais objetiva, que consiste de um sensor de força montado sob o substrato para medir a força aplicada ao contato das sondas na superfície. 12 alinhamento foi alcançado assim, ajustando os ângulos de inclinação para maximizar a força exercida, que indicou que todas as sondas foram simultaneamente em contato. Esse método mostrou que o alinhamento de 0,004 ° do paralelo de superfície era possível. Esta ‘força gabarito nivelamento’ agora foi implementado em sistemas totalmente automatizados em dois relatórios independentes. 13 , 14 tanto usar uma tríade de sensores de força montado sob o substrato ou acima a matriz e medir a quantidade de força exercida sobre o contato entre as matrizes de sonda e a superfície. Estes sistemas dão alta precisão, relatando desalinhamentos de ≤0.001 ° sobre uma escala de comprimento de 1 cm,14 ou ≤ 0.0003 ° 1.4 cm.13 estes sistemas de alinhamento automático também fornecem grandes economias em tempo operador e geral tempo levado para completar o processo de litografia.

Uma aplicação importante da elevado-produção fabricação superfície ativada por esta tecnologia é a geração de substratos de cultura de células. Agora está bem estabelecido que fenótipo celular pode ser manipulado, controlando a interação inicial entre células e características da superfície, e que este pode ser reforçada em nanoescala. 15 especificamente, digitalização métodos de litografia de sonda tem demonstrados ser um método fácil para produzir uma variedade de superfícies de nanofabricated para tais experiências de cultura de células. 16 por exemplo, superfícies apresentando padrões de escala nanométrica de monocamadas auto montadas e matriz extracelular proteínas modeladas pelo PPL e DPN foram usadas para estudar o potencial de materiais nano-modificado em material induziu a diferenciação de células-tronco. 17

Este protocolo descreve a utilização de um sistema de microscópio (AFM) de força atômica modificado que permite grande área PPL. Detalhamos a detecção de força usando vários sensores de força como meios de determinar a sonda-superfície contato, juntamente com um algoritmo que automatiza o processo iterativo de alinhamento. Functionalization subsequente desses padrões com a fibronectina de proteínas da matriz extracelular e a cultura de células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) são descritos, como uma demonstração de superfícies PPL-fabricadas aplicado para cultura de células.

Protocol

1. fabricação da matriz de caneta PPL Para preparar a mistura de copolímero de polidimetilsiloxano (PDMS): Adicionar 10 µ l da platina (0) – 1,3 – divinil-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane solução complexa e 172 µ l de 1,3,5,7-tetrametil-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane de 250 g de (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimetilssiloxano co polímero. Misture estes componentes completamente em um misturador rotativo durante 7 dias garantir uma mistura homogênea.Cuidado: platina (0) – 1,3 – divinil-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane é tóxico. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Adicionar 0,5 g de (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-polímero co dimetilssiloxano para uma porção de 1,7 g de mistura da etapa 1.1.1 uma pesagem do barco e misture bem com uma espátula. Desgaseifica esta mistura por transferi-lo para um dessecador a vácuo e expondo a mistura de baixa pressão (200 mTorr, 0,3 mBar) por 20 min até todas as bolhas de gás tem se dissipado. Lugar cheio de uma lâmina de vidro de 13 x 13 mm em um frasco plástico de parafuso-coberto com 20 mL 2-propanol, em seguida, coloque o frasco em um banho ultra-sônico para 10 min remover quaisquer detritos grandes. Lave os slides submergindo os slides em fresco 2-propanol (100 mL) e seque sob um fluxo de gás nitrogênio. Coloque um mestre de silício18 em um prato de petri de diâmetro de 4 cm e adicionar suficiente desgaseificado PDMS prepolymer mistura (da etapa 1.1) até totalmente coberto. Normalmente, 100 µ l é necessário para um mestre de 20 x 20 mm. Lugar do mestre com a mistura prepolymer em um vácuo exsicador. Desgaseifica o polímero para um mais 5 min remover quaisquer bolhas de gás formadas durante a transferência da mistura. O tratamento de plasma O2 das lâminas de vidro (etapa 1.4 abaixo) deve ser realizado enquanto a desgaseificação está ocorrendo. Trate os quadrados de vidro com plasma de O2 (600 mTorr) à máxima potência de RF para 1 min para remover qualquer contaminação orgânica e gerar uma camada de óxido uniforme no vidro para adesão do elastômero. 19 uso do plasma Tratado slides imediatamente na próxima etapa. Cuidadosamente coloque a lâmina de vidro quadrado (da etapa 1.4) sobre o pré-polímero no master (da etapa 1.3) com o lado limpo-plasma virado para baixo. Pressione suavemente a lâmina de vidro para o mestre de silício para remover todo o ar aprisionado e certifique-se de que uma película uniforme de PDMS é imprensada entre o mestre e o slide. Lugar, a matriz PDMS imprensada cima passo em uma placa de Petri com o silício mestre na parte inferior (ou seja, com as costas da lâmina de vidro virada para cima) e coloque o prato no forno a 70−80 ° C para 24−48 h curar termicamente o PDMS. Retire a matriz curada do forno e deixe esfriar por 15 min, em seguida, com uma lâmina de barbear cuidadosamente remover qualquer excesso PDMS da parte traseira e os lados do vidro deslize e usam um fluxo de nitrogênio seco para sopre quaisquer detritos soltos de PDMS.Nota: tenha cuidado para não riscar o mestre de silício com a lâmina de barbear, que isso poderá danificar o revestimento antiaderente. Cunha de uma lâmina de barbear para o canto da matriz em uma profundidade de 1 mm e cuidadosamente erguer a matriz além do mestre. Executar esta ação em uma única ação de elevação contínua; Não permita que as matrizes para voltar a cair para o mestre. Corte com cuidado e raspar a 0,5 mm do PDMS nas bordas da matriz com uma lâmina de barbear. Use um fluxo de nitrogênio seco para sopre quaisquer detritos soltos de PDMS.Nota: Pode ser mais fácil de executar essa etapa de aparamento sob estereoscópio ou uma lupa. Tenha cuidado para não riscar o mestre de silício com a lâmina de barbear, que isso poderá danificar o revestimento antiaderente. 2. preparação e montagem de substrato de matriz Gere uma superfície hidrofílica na matriz de sonda pelo tratamento de plasma O2 : Coloque a matriz de caneta do PPL em uma placa de Petri para câmara de plasma, em seguida, aplicar vácuo para 600 mTorr. Ligue o gerador de plasma (configuração máxima) por 30 s. Liberar o vácuo, remova a matriz e verifique sua Hidrofilia descartando 20 µ l de água deionizada para a matriz e observar se há mesmo espalhando da água através da superfície. Se isso não ocorrer, sujeito a matriz para uma segunda rodada de tratamento de plasma. Depois, seque a matriz completamente com um fluxo de gás nitrogênio seco. Usando a fita dupla-face de carbono, anexe a matriz para o meio do titular da sonda. Monte a porta-sonda para o titular de cinemática de AFM (Figura 2). Para carregar a matriz PPL com ácido 16-mercaptohexadecanoic (MHA) (‘tinta’): Prepare 1 mM 16-mercaptohexadecanoic ácido (MHA) solução dissolvendo 8,6 mg em 30 mL de etanol em um tubo e colocando-o em um banho ultra-sônico para 10 min dissolver totalmente o composto.Cuidado: 16-mercaptohexadecanoic ácido é tóxico. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Utilizando uma micropipeta, gota de depósito 20 µ l da solução de MHA na matriz. Evite o contacto das pontas de pipeta com as matrizes. Permita que se espalhou por toda a matriz e, em seguida, permitir que o etanol evapora-se em condições ambientes.Nota: A matriz PPL pode alternativamente ser com tinta após o alinhamento tenha ocorrido. 10 Uma vez que a solução MHA secou, monte o porta-sonda com a matriz PPL para o AFM. 3. preparação de substratos de ouro para o PPL. Substratos de ouro podem ser comprados, ou feitos internamente pelo thermal ou elétron deposição do feixe e são construídos de uma camada adesão de titânio nm 2 seguido de 20 nm de ouro em uma bolacha de vidro ou silicone. 18 Se necessário, limpe os substratos por tratamento de plasma de oxigênio usando os parâmetros descritos na etapa 1.4. Coloque o substrato ouro no meio do palco de amostra AFM e prenda com fita adesiva ao redor das fronteiras do substrato (Figura 2). Ajustar o estágio para a altura correta conforme indicado no manual de instruções do fabricante usando o z-controlador de eixo. 4. automático alinhamento de matriz de caneta Abrir e executar o controlador de palco (SetupNSF.exe) do programa de instalação no computador para redefinir (‘zero’) todos os eixos e ângulos de um pré-calibrados ponto zero, em seguida, usar o palco x/y-console de controlador de eixo para mover o substrato para o alinhamento desejado / posição da impressão. Para obter melhores resultados, o substrato deve ser colocado perto do centro do palco, entre os sensores de força do palco.Nota: em alguns modelos de computador, a x/y-sinal de linha central controlador USB pode interferir com isso de a z-controlador de eixo. Se isso ocorrer, desligue o x/y-controlador de eixo USB cabo após esta etapa. -Então deve ser reconectado após o procedimento de alinhamento (etapa 4.7). Interruptor de alavanca de liberação do palco para liberar a fase de amostra e ativar a Tríade de sensores de força conforme indicado pelas instruções do fabricante AFM. Permitir que os sensores de força equilibrar-se pelo menos 15 min. Para obter melhores resultados, permitir que 30-50 min. Aumente a altura do eixo z para trazer a matriz em estreita proximidade com o substrato, observando visualmente a matriz da sonda e a superfície.Nota: Quanto mais perto a matriz para a superfície, as menos iterações são necessárias para o processo de alinhamento, economizando assim tempo. Abrir/executar o programa de alinhamento automático (Auto alinhamento v16.exe) e inserir parâmetros de alinhamento no programa. Digite o valor do parâmetro desejado ‘ângulo de passo’, tipicamente de 0,15 °. Este parâmetro é o ângulo de deslocamento entre o ângulo ‘ideal’ para cada eixo é determinado pelo programa. Defina este parâmetro entre 0,1 e 0,2 °, como ângulos inferiores desta escala não resultar em uma diferença de força claramente detectável na abordagem das sondas para a superfície.Nota: O Software aceita valores em millidegrees (ou seja,, 1 x 10-3 °). Por exemplo, para 0,15 °, os usuários devem entrada ‘150’. Entrando o passo desejado grosseiros ‘ valor do parâmetro, tipicamente 0,6 µm. Este parâmetro é o tamanho de etapa de eixo z usado pela fase que se aproxima as sondas no alinhamento inicial áspera. Defina este parâmetro entre 0,2 e 1 µm. Larger passo diminuição de tamanhos o tempo necessário para o processo de alinhamento, mas reduzir a precisão do alinhamento e aumentar o desgaste sobre as sondas.Nota: O Software aceita valores grosseiros medidas em micrômetros. Por exemplo, para 0,6 µm usuários devem entrada ‘0.6’. Digite o valor desejado de parâmetro ‘Passo fino’, tipicamente de 0,2 µm. Este parâmetro é o tamanho de etapa de eixo z usado para ajuste fino do alinhamento ideal. A maioria dos aplicativos, defina este parâmetro entre 0,1 e 0,4 µm. valor passo tamanhos maiores irão diminuir a quantidade de tempo necessário para o processo de alinhamento, mas reduzir a qualidade do alinhamento.Nota: O Software aceita valores de passos bem em micrômetros. Por exemplo, para 0,2 µm, os usuários devem entrada ‘0.2.’ Configurar o caminho do arquivo’ Excel’ e anexar uma cópia sem modificações do arquivo de modelo de planilha fornecida usando o ícone de ‘pasta’, navegando até o local do arquivo e pressionando ‘Okey’. Este arquivo contém os dados brutos e calculados que são usados para determinar os ângulos de inclinação óptima fase do estágio. Abrir/executar o software de controle AFM. Navegue para o componente de espectroscopia deste programa clicando no botão ‘espectroscopia’ (de acordo com as instruções do fabricante) e definir o AFM varredura cabeça do eixo z para oscilar por 10 µm mais de 100 ms, com um tempo de pausa de 250 ms, então para retrair a 10 µm mais de 100 ms com um tempo de pausa de 250 ms (Figura 3). Como a cabeça AFM é oscilante, clique no botão ‘Iniciar’ do software para iniciar o processo automatizado de alinhamento alinhamento. Quando o programa estiver sendo executado, o software é escrita e leitura de dados no arquivo descrito na etapa 4.4.4.Nota: O alinhamento leva entre 30 min e 3h dependendo da posição de fase inicial definida no passo 4.3 e configuração de software que foram inseridos na etapa 4.4.Atenção: Os consoles de controlador de palco ainda estão ativos durante o processo de alinhamento – não usá-los durante o processo de alinhamento que que interferem com o alinhamento. Quando termina o alinhamento, acende a luz verde caixa ‘Alinhamento concluído’ sobre o software de alinhamento (da etapa 4.4). Quando isso ocorrer, clique no botão ‘STOP’ na interface de usuário para finalizar o processo de alinhamento. Inspecione os gráficos no arquivo de modelo de planilha para uma correlação entre pontos de dados gravados e a linha de ajuste que é gerada pelo software. Ver resultados representativos para obter exemplos de uma boa correlação, com valores típicos de2 R de > 0,99. Se o alinhamento não for bem sucedido, substituir a matriz de sonda com uma matriz recém preparada (passo 2) e repetir o alinhamento (etapa 4.4). Mova o palco para cima na z-eixo usando o console do controlador de palco de eixo. O estágio deve ser movido em incrementos de 500 nm até o contato pode ser observado da câmera vista superior do AFM. Contacto entre a matriz e o substrato pode ser observada como um ponto de’ branco’ de alto contraste no ápice das pirâmides sonda individual. Neste ponto, clique no botão ‘stop’ sobre o software de controle AFM para parar o programa de espectroscopia da etapa 4.5. Isto fará com que retorne a matriz por 10 µm, deixando, portanto, 10 µm de extensão possível do eixo z. Verifique a imagem da câmera vista superior da AFM para garantir que as sondas não estão em contacto com o substrato. 5. litografia de caneta polímero (PPL) Navegue para o componente de litografia do software controle clicando no botão ‘litografia’ no software de controle. Escolha o z-modulação de modo de operação e importar um raster (bitmap) ou imagem que será usada como o padrão de litografia de vetor. A fim de gerar as características mostradas nos resultados representativos, use um bitmap composto de 20 x 20 pixels pretos (ver material suplementar), correspondente a litografia de um grid de 20 x 20 pontos por sonda na matriz de PPL. Inserir os parâmetros de litografia na janela ‘Importação de gráficos Pixel’ do software controlador AFM. Configure o ‘tamanho’ do padrão a ser gerado, por exemplo, 40 µm de comprimento e largura. Esses parâmetros indicam a largura e o comprimento sobre o qual será dimensionada a imagem em bitmap. Para gerar características mostradas nos resultados representativos, use uma largura e comprimento de 40 µm em ambas as dimensões. Conjunto de ‘origem’ do padrão a ser gerado em 25 µm no eixo x e y . Estes parâmetros determinam o centro da imagem em relação ao centro do AFM x/y-eixos. Defina estes parâmetros para evitar a região da superfície onde as sondas foram em contato durante o processo de alinhamento. Defina a impressão ‘Parâmetros’. Estes valores determinam como as sondas devem ser estendido (ou seja, trouxe em contacto com a superfície) em resposta a cada pixel da imagem de bitmap. Selecione o menu drop-down ‘Modulação Abs Z Pos’ e ‘Simplificar a’ duas camadas. Este modo instrui o AFM para estender as sondas por uma distância absoluta determinada por apenas dois resultados, ou ‘Preto (0)’ ou campos de ‘White (1)’. Defina os valores nos campos ‘White (1)’ e ‘Preto (0)’ a 5 e -5 µm, respectivamente. Esses valores de determinar a distância, as sondas devem ser movidas em resposta a um pixel preto ou branco na imagem bitmap e são tipicamente conjunto entre 3 e 5 µm para o ‘Preto’ (ou seja, estender a sondas para baixo por essa distância em relação ao ponto zero do eixo) e -3 a-5 µm para o ‘Branco’ (ou seja, retirar as sondas para cima por 3 a 5 µm em relação ao ponto zero).Observação: Estas distâncias representante assumem que uma extensão de 5 µm resulta nas sondas que entram em contacto com a superfície e, consequentemente, a geração de um recurso, enquanto que uma retirada de 5 µm levanta as sondas longe da superfície resultando em nenhum contato. Z-extensão afeta o tamanho do recurso, determinando a extensão do contato da sonda com o resultado de extensões de superfície, maior nas sondas sendo pressionado mais na superfície, resultando em maiores recursos. 10 Clique no botão ‘Okey’ para implementar essas configurações e fechar a janela. Introduza o tempo de’ pausa’ na janela de litografia do software de controle AFM, tipicamente 1 s. Essa configuração determina o comprimento de tempo que as sondas permanecem na posição estendida de ‘Preto’, que normalmente é definida entre 0,1 e 10 s.Nota: Os tempos de pausa mais resultam em maiores tamanhos de recurso devido à maior quantidade de MHA transportado para a superfície de ouro. Mais detalhes sobre como controlar o tamanho dos recursos gerados podem ser encontrados em outros relatórios. 20 Prepare o gabinete de controle atmosférico. Abaixe a câmara de isolamento atmosférico para o AFM e abrir/executar o software fornecido pelo fabricante controle atmosférico (MHG_control.exe). Defina o software de controle atmosférico para manter uma umidade relativa de 45%, temperatura de 25 ° C e uma atmosfera de troca ‘Taxa de fluxo’ de 500 mL, inserindo esses valores no software. Clique em ‘Usar’ para implementar as configurações. O módulo de controle atmosférico começará então bombear ar dentro da câmara.Nota: Níveis mais elevados de umidade resultam em maiores tamanhos de recurso devido à formação de um menisco de água maior gerado entre a superfície e matrizes de caneta. 21 este valor é normalmente definido entre 40 e 60%. A taxa de fluxo é normalmente definida entre 300 e 500 mL. Maiores fluxos permitem que o nível de humidade desejado a ser alcançado mais rapidamente, mas é menos precisos. Os resultados representativos usar uma taxa de fluxo de 500 mL para geração inicial de umidade e é reduzida para 300 mL, ao atingir a umidade desejada, para manter um nível exato e estável durante a litografia. Uma vez que a umidade desejada é obtida, inicie a sequência litográfica, pressionando o botão ‘start’ sobre a interface do software. Após a conclusão da litografia, use o console de controlador de fase do eixo z para mover o substrato longe da matriz por retraindo o palco por 500 µm. Remova a câmara de isolamento atmosférico do seu monte. Mudar a alavanca de liberação do palco para fechar a fase de amostra e desactivar os sensores de força, conforme indicado pelas instruções do fabricante AFM e, em seguida, remover o substrato do palco. 6. visualização padrão Os padrões podem ser visualizadas usando um dos seguintes métodos, lateral força gravura de microscopia ou químicos, sonda de varredura. Verificar a superfície padronizada em AFM com modo de força lateral usando modilhão modo contato para examinar os recursos sem danificá-los.Nota: A microscopia de força Lateral pode ser usada como um método não destrutivo de visualização as características produzidas por litografia de caneta de polímero; no entanto, apenas uma área relativamente pequena usando este método, pode ser visualizada (tipicamente 100 x 100 µm). Já que a MHA depositado pode atuar como um etch resist, decapagem química pode ser usada para remover o ouro das áreas não-padronizada. As áreas de unetched resultantes depois podem ser visualizadas por microscopia óptica, significando que uma vasta área pode ser vista de uma só vez. 18Nota: Substratos que estão gravados desta maneira então não podem ser usados para os experimentos de cultura celular subsequente descritos abaixo. Separadamente, prepare soluções aquosas de tioureia 40mm, nitrato de ferro (III) de 27 mM e 100 mM o ácido clorídrico. Prepare o condicionador pela mistura de 5ml de cada uma dessas três soluções. Na hora de misturar antes de cada utilização. 22Cuidado: tioureia, nitrato de ferro (III) e ácido clorídrico são tóxicos. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Transferi o substrato modelado em um tubo de ensaio e pipetas etchant solução suficiente para o prato para cobrir a superfície do substrato (tipicamente de 10 mL). Manter o substrato submergido por 4-5 min gravar 15 nm de ouro (a uma taxa aproximada de 3 nm/min). Quando a gravação estiver concluída, retire o substrato e enxaguar cuidadosamente com água e secar com um fluxo de nitrogênio.Nota: A conclusão do processo de decapagem é determinada pela espessura de ouro superfície obtido (passo 3.1) associado com a gravura taxa especificada (passo 6.2.2). Inspecione as características de ouro gravadas sob microscopia óptica de campo brilhante. As restantes características de ouro que permanecem devem aparecer correspondentes ao padrão que foi impresso (da etapa 5.2). Se toda a superfície parece homogênea, isso indica que uma quantidade significativa de ouro permanece e a etapa de condicionamento (seguir passo 6.2.2) deve ser repetida para 1-2 min. 7. padrão functionalization com fibronectina Mergulhe os substratos estampados em uma solução de solução de hexa(ethylene glycol) de 1 mM (11-mercaptoundecyl) em etanol por 1 h. lavagem do substrato três vezes com etanol e seque muito bem sob uma corrente de azoto. Esta etapa promove as unpatterned áreas de ouro.Atenção: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) é tóxico. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Mergulhe os substratos em uma solução aquosa de Co (NO3)2 por 5 min de 10 mM. Em seguida, retire os substratos da solução, lavar três vezes com água ultrapura e secar sob um fluxo de nitrogênio seco.Atenção: O Co (NO3)2 é tóxico. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Mergulhe o substrato em uma solução de 50 µ g/mL de fibronectina na salina tamponada fosfato (PBS) e incube a 4 ° C, durante 16 h. o substrato de lavar três vezes com PBS e, em seguida, secar o substrato sob um fluxo de nitrogênio seco.Nota: Fibronectina é vinculada às áreas MHA-acrescida através da quelação de Co(II) pelos grupos carboxila terminal na MHA. Fibronectina em seguida, vincula o Co(II) através de seu domínio de ligação de colágeno. 23 Se desejar, visualize a fibronectina de superfície limite pela rotulagem-lo com anticorpos fluorescentes: Aplicar uma solução de 2 mL de anticorpo primário de 1: 100 unconjugated coelho antifibronectina em 5% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS na superfície e incubar a 4 ° C, durante 16 h. Aspire o sobrenadante e lavar três vezes com PBS. Submergir o substrato em uma solução de 2 mL de conjugado fluorescente anticoelho anticorpo secundário (a diluição especificado do fabricante, 2 gotas/mL) em 5% (p/v) de BSA em PBS, cobrir em folha de estanho e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. aspirado o sobrenadante e lavar três vezes com PBS. Gravar as imagens de microscopia de epifluorescência a recursos usando um microscópio de fluorescência, de acordo com as instruções do fabricante, com um filtro de excitação definido como 594 nm. 8. célula cultura na nanofabricated superfícies Prepare uma suspensão de hMSCs bem caracterizadas que estão entre os 4th e 6th de passagem. 24 Suspender um balão confluente de células enxaguando uma vez com 10 mL de PBS, dissociar as células aderidas pela adição de 5 mL de tripsina/EDTA para o balão de cultura de tecidos de T75 e incubar o frasco numa câmara umidificado a 37 ° C, suplementado com 5% de CO2 para até 5 min. até 90% o células f estão separadas da superfície. Posteriormente, adicionar 6 mL de meios de cultura fresco contendo 10% de soro fetal bezerro (FCS) para o balão e brevemente, lavar o balão com a mídia adicionada. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 400g a 25 ° C por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 3 mL de meio de cultura fresco. Contar a densidade celular usando um hemocytometer25 e ajustar a densidade da suspensão celular a 2 x 104 células/mL pela adição de um volume adequado de meios de cultura. Sementes das células para substratos em uma densidade de 104 células/cm2. Corte o substrato em 1 x 1 cm2 com escriba de diamante e colocá-lo em um poço na placa de cultura de tecido 12-bem. Pipetar 2 mL da suspensão de células em meios de cultura (da etapa 8.1.4) para o poço e incubá-los numa câmara umidificada a 37 ° C, suplementado com 5% de CO2 por 24 h. Após o crescimento de células sobre os padrões, analise o grau de fixação da célula e se espalhando por imunofluorescência: Remova a mídia e lave substratos uma vez com PBS. Fixe as células com 2 mL de uma solução de paraformaldeído 4% em PBS (pré aquecido a 37 ° C) por 20 min na coifa e lavar três vezes com PBS.Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Por favor, leia o MSDS antes de trabalhar com esta solução. Equipamento de segurança é obrigatório durante o manuseio do produto químico. Permeabilize as células com 2 mL de uma solução de detergente de 0,5% (ver Tabela de materiais) em PBS por 15 min, em seguida, lave tres vezes com PBS. Submergir o substrato em 2 mL de uma solução de anticorpo primário de coelho unconjugated antifibronectina na diluição de 1: 100 com 5% (p/v) BSA em PBS e incubar a 4 ° C, durante 16 h e, em seguida, lavar três vezes com 0,1% (v/v) Tween 20 em PBS (PBST). Posteriormente submergir o substrato em 2 mL de uma solução de fluorescente conjugado anticorpo secundário anticoelho (diluído com 5% (p/v) BSA em PBS a diluição especificada pelo fabricante, a 2 gotas/mL), capa em papel alumínio e incubar a temperatura ambiente durante 1 h, em seguida, lavar três vezes com 0,1% PBST. Para rotular os filamentos de actina, submergir 2ml de faloidina fluorescente conjugada a uma diluição de 1: 250 em PBS, cobrir em folha de estanho e incubar a 4 ° C por 30 min e depois lave tres vezes com PBS. Simultaneamente, mancha do núcleo de células e montar o substrato aplicando uma gota de montagem média contendo DAPI e cobrir com uma lamela. Visualizar as células usando um microscópio de fluorescência, de acordo com as instruções do fabricante, com filtros de excitação de 365 nm para núcleos (DAPI), 488 nm para F-Actina e 594 nm para fibronectina.

Representative Results

Para verificar se o alinhamento automático tinha sido bem sucedido, foram examinados os gráficos plotados a partir dos dados de alinhamento (na planilha da etapa 4.8). Onde o processo de alinhamento tinha sido bem sucedido as duas parcelas, correspondentes ao ângulo pelo qual o estágio de amostra tem sido inclinado ao longo dos eixos θ e φ, mostraram uma série de subindo e descendo os pontos de dados. Em cada um dos lotes, dois ajustes lineares dos pontos de dados mostraram um intersect bem-definidos “pico”, indicando o máximo z-extensão e o ângulo correspondente no qual alinhamento foi alcançado (Figura 4A e 4B). Este processo é repetido quatro vezes (ou seja, duas vezes para cada eixo) e plotados como um conjunto de quatro coordenadas. A interseção de cada par de coordenadas, portanto, mostra os ângulos total ideal (Figura 4). 13 em casos onde o alinhamento não foi bem sucedido, pode-se observar que sua correspondente θ e φ ângulo parcelas não dá ataques linear de boa qualidade, ou não se interceptam (Figura 5). Tais alinhamentos falhados são tipicamente como resultado as matrizes sendo indevidamente aparadas ou montado no suporte da sonda (etapas 1.7, 1.8 e 2.2). Nestes casos, as matrizes foram descartadas e um novo preparado e montado (etapas 1 e 2), e o processo de alinhamento repetido (passo 4). Alinhamento bem sucedido e a litografia com MHA por PPL, substratos de ouro estampados foram então fotografados usando microscopia de força lateral para examinar se o depoimento tinha ocorrido. Um exame de área maior da superfície impressa também foi conduzido por microscopia óptica de substratos após condicionamento do ouro não protegido pelo tiol depositado (Figura 6 e Figura 7). No entanto, os padrões gravados não podem ser usados para mais functionalization e só devem ser usados para confirmar a padronização em amostras representativas de um lote de substratos de superfície impressos. Se os padrões gravados mostram áreas em branco correspondente ao baias individuais (Figura 8), este resultado indica que a produção de matrizes de sonda não foi feita com sucesso, e que algumas sondas são danificados ou ausentes. Esta homogeneidade das sondas pode ser devido ao uso de um velho mestre onde o revestimento perfluorados desgastou fora (etapa 1.3), resultando em algumas sondas sendo arrancadas quando a matriz é separadoda do mestre. Nestes casos, deve ser usado um novo mestre. O resultado também pode ser devido à presença de ar bolhas preso entre o vidro de apoio e o mestre (passo 1.5), ou se a matriz de sonda não foi limpa separada do mestre após a cura (passo 1.8). Imagens de microscopia fluorescente das superfícies fibronectina acrescida hMSCs incubadas foram também coletados (Figura 9). Em geral, todos os substratos foram estáveis dentro do ambiente de cultura em vitro e as células se adere e adaptaram a sua morfologia para os padrões impressos em caso de menor isolada 20×20 a variedade de recursos. Figura 1. Representação esquemática da litografia de caneta de polímero mostrando tinta molecular transporte através de um menisco de água na ponta da sonda. (A) vista lateral e (B) superior vista da matriz de polímero caneta indicam que quando a matriz de sonda e o substrato de superfície são totalmente alinhadas, todas as sondas entrem em contacto com a superfície simultaneamente, resultando em litografia em paralelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Diagrama esquemático da litografia de polímero caneta conjunto cima (A) vista lateral expandido conjunto experimental onde a matriz preparada sonda é anexada para sondar o titular e montada para o scanner de AFM. O substrato é colocado no palco, abaixo da qual estão localizados os três força sensores. (B) uma representação da instrumentação montada, mostrando a cabeça de varredura AFM em relação à fase de amostra. Vista de (C) inferior mostrando a localização do sensor de força. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Representação esquemática representando o programa de espectroscopia para o procedimento de alinhamento. O scanner AFM é definido para mover as sondas em direção a amostra por uma distância de 10 µm dentro de 100 ms, realizada na posição para 250 ms, seguido de uma retração de 10 µm dentro de 100 ms e mantidos durante 250 ms na posição retraída. O movimento é então repetido durante todo o processo de alinhamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Gráficos ilustrando um alinhamento sucesso. Gráficos de posição de z contra os ângulos de inclinação (A) θ e φ (B) para um alinhamento bem sucedido, onde ● indica valores reais medidos e + indica o melhor encaixam com o método de mínimos quadrados. (C) gráfico de φ contra θ montado ângulos com os quatro pontos onde o z-posição máximo foi alcançado. O ponto de interseção marcado é o ângulo de inclinação ideal final em ambos os eixos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Gráficos ilustrando um alinhamento malsucedido. Gráficos de posição de z contra os ângulos de inclinação (A) θ e φ (B) para um alinhamento malsucedido, onde ● indica valores reais medidos e + indica o melhor encaixam com o método de mínimos quadrados. (C) gráfico de φ contra θ montado ângulos com os quatro pontos onde o z-posição máximo foi alcançado. Não optima clara ou ponto de interseção são observados e, portanto, os ângulos de alinhamento ideal não são resolvidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Microscopia óptica ilustrativa e imagens de microscopia de força atômica de substratos de ouro que foram estampados com MHA as matrizes de PPL alinhados e então gravados. (A) e (B) são imagens de microscopia óptica sequencialmente ampliada dos padrões gravados; (C) é uma imagem de topografia AFM de uma grade única de padrões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. Imagens de microscopia óptica ilustrativos de substratos de ouro que foram estampados com MHA as matrizes de PPL alinhados e então gravados. (A) e (B) são imagens de microscopia óptica sequencialmente ampliada dos padrões jateados e (C) é uma imagem de ampliação inferior que mostra grande área padrões homogêneos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8. Imagem de microscopia óptica ilustrativos de um substrato de ouro que foi desigual estampado com MHA e então gravado. Os padrões pretendidos (constantes o baixo-relevo) estavam repetindo grades de 20 linhas de ponto dispostas em 20 linhas, com cada duas linhas produzidas aumentando o z-extensão no eixo 1 µm (variando de 5 a-5 µm). Pode ser visto que em algumas áreas não padrões são gerados, devido à falta de sondas nesses locais. Nas áreas onde apenas duas linhas de pontos são produzidas, este resultado indica que a sonda está presente, mas não é da mesma altura como o pleno funcionamento de sondas, então único depósito apresenta quando a matriz é estendida para o completo z-distância do eixo. Nesta imagem, o contraste foi deliberadamente alterado para permitir a observação das áreas parcialmente impressas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9. Imagens de microscopia de epifluorescência de hMSCs cultivadas sobre as matrizes de fibronectina modeladas por PPL. (A) e (B) são imagens de alta ampliação mostrando células individuais. (C) mostra um padrão de exemplo da matriz sem um aderente de fibronectina celular e (D) é uma imagem de campo largo das células cultivadas em um arranjo de grade (um esquema do padrão impresso também consta o embutimento). As células são coradas para mostrar a fibronectina (vermelho), F-Actina (verde) e núcleo (azul) de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo serve para fornecer aos usuários uma metodologia conveniente efectuar rapidamente nanolithographic padronização com alta uniformidade e tamanho controlável recurso sobre grandes áreas (cm2). Substratos estes nanopatterns de grande área de rolamento podem ser ainda mais elaborados para uma variedade de aplicações. Uma aplicação importante desta tecnologia é na geração de superfícies de nanofabricated para estudos de interação da pilha-superfície. Este relatório mostra alguns exemplos ilustrativos de cultura celular nesses materiais, demonstrando o controle da morfologia de hMSC por substratos nanofabricated.

O fator fundamental do presente protocolo é a automação do processo de alinhamento (etapa 4) que permite uma produção altamente uniforme e de alta produtividade de recursos em superfícies, até resolução nanoescala, que permite que o ritmo acelerado das experiências da cultura de pilha. A litografia de caneta de polímero realizada usando esse algoritmo de alinhamento é capaz de gerar recursos de nanoescala dentro de aproximadamente 30 min. A reprodutibilidade e a precisão do alinhamento automático e, portanto, a uniformidade das características padronizadas, é no entanto criticamente dependente na qualidade das matrizes sonda que são produzidos (passo 1 e 2). Falhas na sua elaboração que resultam em pontas de prova contundente, quebradas ou falta; como o ar aprisionado bolhas (passo 1.5) ou separação indevida das sondas do mestre (passo 1.8) pode resultar em alinhamento inexato e litografia de má qualidade.

Isso relatado método compartilha uma limitação em comum com outros métodos de alinhamento que dependem de reorientação de força. A determinação exata de quando os testes que estão em contacto com a superfície é limitada pela necessidade de contabilizar as vibrações de fundo causadas pelo ambiente e o movimento da fase de amostra. Em geral, os sensores têm uma sensibilidade de força no regime µN (2 µN neste caso), mas o algoritmo de alinhamento é projetado para apenas registar-se uma força pelo menos 490 µN como contato definitivo entre as sondas e a superfície, para evitar qualquer resul ‘falsos positivos’ Ting do ruído de fundo. 13 assim, esse método tende a produzir grandes recursos (1-2 µm) desde que as sondas deve estendeu uma distância grande sobre o z-eixo (com uma consequente força superior) para registrar o contato. Para compensar, características menores podem ser geradas, reduzindo o z-eixo distância percorrida durante a etapa de litografia (por exemplo, inserir a configuração de ‘Preta’ na etapa 5.2.3.2 como 3 µm em vez de 5 µm).

No entanto, mesmo com essa limitação, o algoritmo de automação é capaz de abordar um aspecto crítico na aplicação dos métodos da litografia de digitalização sonda de em paralelo, como alinhamento anteriormente era mais tempo impreciso e exigente etapa na implementação destas técnicas. Esta automação agora muda o passo limitante do processo de fabricação do alinhamento para a litografia escrevendo sozinho. Enquanto este protocolo demonstra a aplicação deste procedimento de alinhamento para o PPL, o quadro poderia ser aplicado a um número de técnicas SPL como lipid-DPN26 e litografia assistida por matriz27 , bem como o potencial futuro catalítico sistemas de sonda. 28

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio financeiro de uma variedade de fontes, incluindo a UK engenharia e Physical Sciences Research Council (concessão de árbitros. EP/K011685/1, EP/K024485/1) e uma bolsa de estudo de pós-graduação para JH; o Leverhulme Trust (RPG-2014-292); o fundo de apoio estratégico institucional do Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); o British Council (216196834); e da Universidade de Manchester para uma Universidade de Manchester Research Institute (fundo de escorva da bomba UMRI) e uma bolsa de doutoramento presidencial para assistência técnica de SW. pelo Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) é reconhecida também com gratidão.

Materials

Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G
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Lee, I., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).
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