基于自动对准的大面积扫描探针光刻及其在细胞培养研究中的应用

1. 制作的 PPL 笔阵列 制备烷共聚物混合物: 添加10µL 铂 (0)-13-乙烯 11, 33-tetramethyldisiloxane 复杂溶液和172µL 13, 57-四甲基-13, 57-tetravinylcyclotetrasiloxane 到250克 (7-8 w/w vinylmethylsiloxane)-甲基 co 聚合物。将这些组件彻底混合在一个旋转搅拌机上7天, 以确保均匀混合。注意: 铂 (0)-13-乙烯 11, 33-tetramethyldisiloxane 是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 添加0.5 克 (25-35 w/w氢)-甲基共聚合物到一个1.7 克的混合物, 从步骤1.1.1 在一个称量船, 并与铲彻底混合。 将这种混合物转移到真空干燥, 将混合物暴露于低压 (200 mTorr, 0.3 毫巴) 20 分钟, 直到所有的气泡都消散为止。 放置一个 13 x 13 毫米玻璃幻灯片在一个塑料螺丝顶部填充20毫升2丙醇, 然后把瓶子放在一个超声波浴, 以10分钟, 以消除任何大碎片。将幻灯片浸入新鲜的2丙醇 (100 毫升) 中, 并在氮气流下晾干, 以洗涤滑梯。 将硅母版18放入4厘米直径的培养皿中, 并添加足够的脱气预聚体混合物 (从步骤 1.1) 直到完全覆盖。通常, 100 µL 是 20 x 20 mm 的主控形状所必需的。将主与预聚体混合物放在真空 dessicator 中。将聚合物再加5分钟, 以除去在混合物转移过程中形成的任何气泡。O2等离子处理的玻璃幻灯片 (步骤 1.4) 应在进行脱气时进行。 用 O2等离子 (600 mTorr) 在最大射频功率下处理玻璃方块, 以1分钟去除任何有机污染, 并在玻璃上产生均匀的氧化物层, 以粘合弹性体。19在下一步中立即使用等离子处理过的幻灯片。 小心地将方形玻璃滑块 (从步骤 1.4) 放在母版上的预聚物上 (从步骤 1.3) 与等离子清洗侧朝下。轻轻地按下玻璃滑向硅大师, 以消除任何被困的空气, 并确保一个统一的胶片在主和幻灯片之间夹。 把夹在上面台阶上的夹心的, 在一个培养皿与硅大师在底部 (即, 与玻璃幻灯片背面朝上), 并把盘子放在烤箱在70−80°c 24−48 h 加热治疗。 从烤箱中取出已固化的阵列, 并允许冷却15分钟, 然后用剃刀刀片小心地从玻璃滑梯的背面和两侧取出任何多余的硅烷, 并使用一股干氮气吹走任何松散的硅烷碎片。注: 注意不要用刀片刮掉硅师傅, 因为这可能会损坏不粘涂层。 将刀片楔入阵列的角, 深度为1毫米, 并仔细地将阵列与主控形状分开。在一个连续的提升动作中执行此操作;不允许阵列回退到主控形状。 小心地削减和刮走了0.5 毫米的在阵列边缘与刀片刀片。使用一条干氮气来吹走任何松散的。注意: 在立体镜或放大镜下执行此修剪步骤可能更容易。注意不要用剃刀刀片刮掉硅师傅, 因为这可能会损坏不粘涂层。 2. 阵列准备和衬底安装 用 O2等离子处理在探针阵列上生成亲水性表面: 将在培养皿中的 PPL 笔阵列放入等离子腔, 然后将真空应用于 600 mTorr。开关在等离子发生器 (最大设置) 三十年代。 释放真空, 删除阵列, 并检查其亲水性通过下降20µL 的去离子水到阵列, 并观察是否有甚至蔓延的水在水面上。如果不发生这种情况, 则将阵列放到第二轮等离子处理上。之后, 用一股干氮气彻底干燥阵列。 使用双面碳带, 将阵列连接到探头支架的中间。将探头支架安装到 AFM 运动支架上 (图 2)。 要用 16-巯基酸 (MHA) (“墨迹”) 加载 PPL 数组: 1毫米 16-巯基酸 (MHA) 溶液通过溶解8.6 毫克在30毫升乙醇在管子和放置它在一个超声波浴为10分钟完全溶化化合物。警告:16-巯基酸是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 使用微, 在阵列上存入20µL 的 MHA 解决方案。避免与阵列接触吸管提示。允许它扩散到整个阵列, 然后允许乙醇在环境条件下蒸发。注意: 在进行对齐后, PPL 阵列也可以进行墨迹绘制。10 一旦 MHA 溶液干了, 将探头持有者与 PPL 阵列装入 AFM。 3. 为人的黄金基质的制备。 黄金基质可以购买, 或由热或电子束沉积内部, 并建立了2纳米钛粘接层, 其次是20纳米金的玻璃或硅片。18 必要时, 使用步骤1.4 中描述的参数, 用氧等离子体处理来清洁基体。 将金基板置于 AFM 样品阶段的中间, 并在衬底的边界周围用胶带固定 (图 2)。使用z轴控制器将舞台调整到正确的高度, 如制造商的操作说明所示。 4. 笔阵列的自动对准 打开并运行计算机上的舞台控制器安装程序 (SetupNSF.exe), 将所有坐标轴和角度重置为预先校准的零点, 然后使用舞台x/y轴控制器控制台将基板移动到所需的对齐位置/打印位置。为获得最佳结果, 基板应放置在舞台中心附近, 在舞台的力传感器之间。注意: 在某些型号的计算机中, x/y轴控制器 USB 信号可能会干扰z轴控制器。如果出现这种情况, 请在该步骤之后断开x/y轴控制器 USB 电缆。然后在对齐过程 (步骤 4.7) 之后重新连接它。 切换舞台释放拉杆以释放采样阶段, 并激活力传感器的三重, 如 AFM 制造商的说明所示。允许力传感器平衡至少15分钟。为获得最佳结果, 请允许30-50 分钟。 通过直观地观察探头阵列和曲面, 增加 z 轴高度, 使阵列与衬底接近。注意: 数组与曲面的距离越近, 对齐过程所需的迭代就越少, 从而节省了时间。 打开/运行自动对齐程序 (自动对齐 v16.exe), 并在程序中输入相关的对齐参数。 输入所需的 “角度步长” 参数值, 通常为0.15°。此参数是由程序确定的每个坐标轴的 “最佳” 角度的偏移角度。在0.1 和0.2°之间设置这个参数, 因为比这个范围低的角度不会在探针到表面的方法上产生明显的可探测的力差。注: 软件接受 millidegrees 中的值(即1 x 10-3 °)。例如, 对于 0.15°, 用户应该输入 “150”。 输入所需的粗步长参数值, 通常为0.6 µm。此参数是阶段使用的 z 轴步长, 当它接近初始粗对齐时的探头时。将此参数设置为0.2 到1µm. 较大的步长减小了对齐过程所用的时间, 但降低了对齐的精度, 并增加了探头的磨损。注意: 软件接受微米级粗步骤的值。例如, 对于0.6 µm 用户应该输入 “0.6”。 输入所需的 “精细步骤” 参数值, 通常为0.2 µm。此参数是用于微调最佳对齐方式的 z 轴步长。对于大多数应用程序, 请在0.1 和0.4 µm 之间设置此参数. 较大的值步长将减少对齐过程所需的时间, 但会降低对齐的质量。注意: 软件接受微米级精细步骤的值。例如, 对于0.2 µm, 用户应该输入 “0.2”。 通过使用 “文件夹” 图标、导航到文件位置并按 “确定”, 配置 “Excel 文件路径” 并附加所提供的电子表格模板文件的未修改副本。此文件包含用于确定舞台最佳阶段倾斜角度的原始数据和计算结果。 打开/运行 AFM 控制软件。通过单击 “光谱学” 按钮 (根据制造商的说明) 导航到该程序的光谱学组件, 并将 AFM 扫描头 z 轴设置为10µm 100 毫秒的振荡, 暂停时间为250毫秒, 然后收回10µm 超过100毫秒暂停时间为250毫秒 (图 3)。 当 AFM 头振荡时, 单击对齐软件的 “开始” 按钮开始自动对齐过程。程序运行时, 软件正在编写和读取步骤4.4.4 中描述的文件中的数据。注意: 根据步骤4.3 中设置的初始阶段位置和在步骤4.4 中输入的软件配置, 对齐过程需要30分钟和3小时。注意: 在对齐过程中, 舞台控制器控制台仍然处于活动状态-不要在对齐过程中使用它们, 因为它会干扰对齐。 当对齐完成后, 对齐软件 (从步骤 4.4) 中的绿色灯箱 “对齐” 将被亮起。发生这种情况时, 请单击用户界面上的 “停止” 按钮以结束对齐过程。 检查电子表格模板文件中的图表, 以获得记录的数据点与软件生成的线条匹配之间的相关性。参见代表性结果为例子的一个好相关, 以典型的 R2价值 > 0.99。如果对齐方式不成功, 请用新准备好的阵列 (步骤 2) 替换探头阵列, 然后重复对齐 (步骤 4.4)。 使用该轴的舞台控制器控制台在z轴上向上移动舞台。该阶段应以 500 nm 的增量移动, 直到接触可以看到从 AFM 的顶部观看相机。阵列和基体之间的接触可以被观察为一个 “白色点” 的高对比度在单个探针金字塔的顶点。 此时, 单击 AFM 控制软件上的 “停止” 按钮, 停止步骤4.5 中的光谱学程序。这将收回阵列10µm, 因此留下10µm 可能的 z 轴扩展。检查从 AFM 的顶部查看相机的图像, 以确保探头不与基体接触。 5. 聚合物笔光刻 (PPL) 通过单击控制软件上的 “光刻” 按钮, 导航到控制软件的光刻组件。选择z调制操作模式并导入将用作光刻图案的光栅 (位图) 或矢量图像。为了生成代表结果中显示的功能, 请使用包含 20 x 20 个黑色像素 (参见补充材料) 的位图, 对应于在 PPL 阵列上每个探头的 20 x 20 点的网格光刻。 在 AFM 控制器软件的 “像素图形导入” 窗口中输入光刻参数。 配置要生成的模式的 “大小”,例如, 40 µm 的长度和宽度。这些参数指示将缩放位图中图像的宽度和长度。要生成代表结果中显示的功能, 请在两个维度中使用40µm 的宽度和长度。 将图案的 “原点” 设置为在x和y轴上以25µm 生成。这些参数确定图像的中心相对于 AFM x/y轴的中心。设置这些参数以避免在对齐过程中探头处于接触面的区域。 设置打印 “参数”。这些值决定了如何将探测器扩展 (即与曲面接触) 以响应位图图像中的每个像素。 从下拉菜单中选择 “调制 Abs Z Pos”, 然后 “简化为” 两层。此模式指示 AFM 将探针扩展到仅由两个结果确定的绝对距离, 即 “黑色 (0)” 或 “白色 (1)” 字段。 分别将 “黑色 (0)” 和 “白色 (1)” 字段中的值设置为5和-5 µm。这些值决定了探测器应在位图图像上的黑色或白色像素之间移动的距离, 通常在3和5µm 之间设置为 “黑色” (即, 相对于该轴的零点, 将探头向下延伸到该距离)。-3 至-5 µm 为 “白色” (即, 相对于零点, 将探头向上提取3到5µm)。注意: 这些代表距离假定5µm 的延伸会导致探头接触到表面, 从而产生一个特征, 而5µm 的退出会将探头从表面上抬起, 从而导致没有接触。Z扩展通过确定与曲面的探针接触范围来影响特征大小, 更大的扩展导致探头被进一步压入表面, 从而产生较大的特征。10 单击 “确定” 按钮以实现这些设置并关闭窗口。 在 AFM 控制软件的光刻窗口中输入 “暂停时间”, 通常为1秒。此设置确定探测器在扩展的 “黑色” 位置中保持的时间长度, 通常设置在0.1 和十年代之间。注: 较长的停顿时间会导致较大的特征尺寸, 原因是 MHA 运输到黄金表面的量较大。有关控制生成的功能大小的进一步详细信息, 可在其他报告中找到。20 准备大气控制罩。 将大气隔离室降低到 AFM 上, 打开/运行制造商提供的大气控制软件 (MHG_control)。 设置大气控制软件, 以保持相对湿度为 45%, 温度为25摄氏度, 大气交换 ‘ 流量 ‘ 的500毫升通过输入这些值到软件中。单击 “使用” 以实现设置。然后, 大气控制模块将开始将空气中的湿润气体注入室内。注: 由于在笔阵列和曲面之间形成较大的水半月板, 因此较高的湿度水平会导致较大的特征尺寸。21此值通常设置在40和60% 之间。流量通常设置在300和500毫升之间。较大的流量使所需的湿度水平能够更快地到达, 但不太准确。代表结果使用500毫升的流速为初始的湿度, 并减少到300毫升后达到预期的湿度, 以保持准确和稳定的水平, 在光刻。 一旦获得所需的湿度, 请按软件界面上的 “开始” 按钮启动平版序列。 在光刻完成后, 使用 z 轴级控制器控制台将基板从阵列中移开, 并将舞台缩回500µm。然后将大气隔离室从其安装中移除。 切换舞台释放拉杆以锁定采样阶段并停用力传感器, 如 AFM 制造商的说明所示, 然后从舞台上移除基板。 6. 模式可视化 可以使用以下方法之一可视化模式: 横向力扫描探针显微镜或化学蚀刻。 用接触模悬臂法对具有侧向力模式的 AFM 上的阵列表面进行扫描, 检查无损检测的特性。注: 横向力显微镜可作为一种无损的方法来观察聚合物笔光刻所产生的特征;但是, 使用这种方法, 只有相对较小的区域才能被可视化 (通常为 100 x 100 µm)。 由于沉积的 MHA 可以作为蚀刻抗蚀剂, 化学蚀刻可用于从非图案化区域中除去黄金。由此产生的 unetched 区域可以通过光学显微术进行可视化, 这意味着可以同时查看一个广阔的区域。18注意: 用这种方法蚀刻的基底不能用于随后的细胞培养实验。 分别制备40毫米硫脲、27毫米铁 (III) 硝酸盐和100毫米盐酸的水溶液。通过混合5毫升的这三解决方案, 准备蚀刻。新的混合之前, 每次使用。22注意: 硫脲, 铁 (III) 硝酸盐和盐酸是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 将图案的基板转移到培养皿中, 并将足够的蚀刻溶液注入盘中, 以覆盖基体表面 (通常为10毫升)。将基底浸入4-5 分钟以蚀刻15纳米金 (以近似 3 nm/分的速度)。 当蚀刻完成后, 取下基体, 用清水彻底冲洗, 用氮气流干。注: 蚀刻过程的完成是由获得的金表面厚度 (步骤 3.1) 与指定的蚀刻速率 (步骤 6.2.2) 决定的。 在光亮场光学显微镜下检查蚀刻金的特征。剩余的黄金功能应与打印的模式 (从步骤5.2 中) 相应显示。如果整个表面看起来均匀, 这表明有大量的黄金残留, 蚀刻步骤 (以下步骤 6.2.2) 应重复1-2 分钟。 7. 纤维连接蛋白的模式功能化 将花纹基质浸入乙醇中1毫米 (11-mercaptoundecyl) 六 (乙二醇) 溶液中, 1 小时. 用乙醇洗涤基体三次, 在氮气流下彻底干燥。这一步钝化了 unpatterned 黄金地区。注意: (11-mercaptoundecyl) 六 (乙二醇) 是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 将基体浸入10毫米 (NO3)2水溶液中5分钟。接着, 从溶液中取出基板, 用超纯水清洗三次, 在干氮气流下干燥。注意: Co (3)2是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 将基质浸泡在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的50µg/毫升的纤维连接蛋白溶液中, 在4摄氏度处孵育16小时. 用 PBS 洗涤基体三次, 然后在干氮气流下干燥基体。注: 纤维连接蛋白通过 MHA 上的羧酸组螯合 (II.) 与 MHA 功能区结合。纤维连接蛋白然后通过其胶原结合的领域绑定到 Co (II.)。23 如果需要, 用荧光抗体对表面约束的纤维连接蛋白进行标记: 应用2毫升溶液1:100 游离兔抗纤连蛋白原抗体 5% (w/v) 的牛血清白蛋白 (BSA) 在 PBS 到表面和孵化4°c 为 16 h. 吸上清液, 用 PBS 洗三次。 将基质浸泡在2毫升溶液中, 荧光共轭抗兔二级抗体 (在制造商指定的稀释, 2 滴/毫升) 的 5% (瓦特/v) 的 BSA 在 PBS, 覆盖在锡纸, 并在室温孵育1小时. 吸入上清和洗三次与 PBS。 根据制造商的说明, 使用荧光显微镜记录荧光显微图像的特征, 并将励磁过滤器设置为 594 nm。 8. nanofabricated 表面的细胞培养 准备悬挂在4和6的通道之间的良好特征的 hMSCs.24 通过冲洗一次与10毫升 PBS, 离解黏附的细胞, 通过添加5毫升的胰蛋白酶/EDTA 进入 T75 组织培养瓶, 并孵化瓶在一个湿润的房间37°c 补充 5% CO2 , 直到 5 o, 暂停一个汇合瓶f 细胞从表面分离出来。 随后, 添加6毫升新鲜培养基, 其中含有10% 胎犊牛血清 (FCS) 到烧瓶中, 并通过添加培养基对烧瓶进行简要冲洗。将电池悬浮液转移到15毫升离心管中, 离心机在400克, 25 摄氏度, 5 分钟。 去除3毫升新鲜培养基中的上清和并用重悬细胞颗粒。 使用 hemocytometer25计算细胞密度, 并通过添加适当数量的培养基将细胞悬浮密度调整为 2 x 104细胞/毫升。 将细胞播种到基质上, 密度为 104细胞/厘米2。 将基体切成 1 x 1 厘米2 , 并将其放在12井组织培养板中的井中。 吸管2毫升细胞悬浮在文化媒介 (从步 8.1.4) 入井和孵化在一个湿化的房间在37°c 补充与 5% CO2为 24 h。 细胞生长后的模式, 分析细胞附着的程度和传播免疫荧光: 用 PBS 去除介质并清洗基底。固定细胞与2毫升溶液的4% 多聚甲醛在 pbs (预热到37°c) 20 分钟在油烟机和洗涤三次与 PBS。注意: 多聚甲醛是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。 Permeabilize 细胞与2毫升溶液0.5% 洗涤剂 (参见材料表) 在 pbs 为15分钟, 然后洗涤三次与 pbs。 将基质浸泡在2毫升的游离兔抗纤连蛋白原抗体稀释1:100 与 5% (瓦特/v) BSA 在 pbs 和孵化在4°c 16 小时, 然后洗三倍 (v/v) 补间0.1% 在 pbs (PBST)。 随后将基质浸泡在2毫升的溶液中, 荧光共轭抗兔二级抗体 (在 PBS 中稀释 5% (瓦特/v) BSA, 在制造商指定的稀释, 2 滴/毫升), 覆盖在锡纸和孵化在室温下的1小时,然后用 0.1% PBST 洗三次。 为了标记肌动蛋白花丝, 淹没2毫升的荧光共轭罗丹明在 PBS 稀释 1:250, 盖在锡纸和孵化在4°c 30 分钟然后洗三次与 PBS。 同时使用含有 DAPI 和盖玻片的安装介质的下落, 同时染色细胞核并安装基体。 可视化细胞使用荧光显微镜根据制造商的指示, 与励磁过滤器365毫微米为核 (DAPI), 488 毫微米为 F 肌动蛋白和594毫微米为纤维粘连蛋白。