JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

منطقة كبيرة Nanolithography مسبار المسح يسرت بمحاذاة تلقائية وتطبيقه على تصنيع الركيزة لدراسات ثقافة الخلية

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/56967
, , , , , ,
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry,University of Manchester, 2School of Engineering,University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering,University of Manchester, 4School of Science and Technology,Nottingham Trent University

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لمنطقة واسعة nanolithography مسبار المسح تمكين بمحاذاة تكرارية من صفائف التحقيق، فضلا عن الاستفادة من أنماط معدني لدراسات التفاعل سطح الخلية.

Abstract

المسح المجهري المسبار قد مكن إنشاء مجموعة متنوعة من الأساليب للتلفيق من أعلى إلى أسفل (‘المضافة’) بناءة من ميزات مقياس نانومتر. تاريخيا، كان عيب رئيسي للمسح مسبار الطباعة الحجرية الإنتاجية منخفضة جوهريا لنظم التحقيق واحد. وقد عولجت باستخدام صفائف تحقيقات متعددة لتمكين nanolithography زيادة الإنتاجية. من أجل تنفيذ هذه نانوليثوجرافي المتوازية، محاذاة دقيقة من صفائف المسبار مع سطح الركازة أمر حيوي، ذلك إجراء تحقيقات في جميع جهات الاتصال مع السطح في نفس الوقت عندما تبدأ الزخرفة معدني. ويصف هذا البروتوكول استخدام البوليمر القلم الطباعة الحجرية لإنتاج ميزات نانومتر على نطاق أكثر المناطق الحجم سنتيمتر، وسهل باستخدام خوارزمية لمحاذاة صفائف التحقيق السريع والدقيق والآلي. هنا، يوضح nanolithography ثيولس على ركائز الذهب جيل الميزات مع التوحيد عالية. ثم يتم فونكتيوناليزيد هذه الأنماط مع فيبرونيكتين لاستخدامها في سياق دراسات مورفولوجية الموجه من سطح الخلية.

Introduction

التقدم في تكنولوجيا النانو يعتمد على تطوير تقنيات قادرة على اختﻻق كفاءة وموثوقية ميزات النانو على الأسطح. 1 , 2 بيد توليد مثل هذا يتميز بمساحات كبيرة (متعددة سم2) موثوق بها وفي التكلفة المنخفضة نسبيا هو مسعى غير تافهة. معظم التقنيات القائمة، المستمدة من صناعة أشباه الموصلات، تعتمد على الجر التصويرية اختﻻق مواد ‘الصعب’. في الآونة الأخيرة، ظهرت تقنيات معدني المستمدة من المسح المسبار المجهري (SPM) كنهج ملائم وتنوعاً للنماذج الأولية السريعة للتصاميم النانو. 3 التقنيات المستندة إلى SPM قادرون على سهولة وسرعة ‘الكتابة’ أي نمط معرف من قبل المستخدم. أكثر معروفة من هذه هو تراجع من ركلة جزاء نانوليثوجرافي (DPN)، بادرت ميركين et al.,4 حيث يتم استخدام مجس مسح ك ‘قلم’ نقل ‘حبر’ جزيئية إلى السطح المنتجة للميزات بطريقة مماثلة للكتابة. في ظل الظروف المحيطة، كما يتم فحص تحقيق عبر سطح الجزيئات ‘حبر’ ينقلون إلى السطح عبر غضروف مياه التي تشكل بين المجس والسطح (الشكل 1). وهكذا يسمح DPN ترسيب نانوليثوجرافيك طائفة واسعة من المواد، بما في ذلك المواد ‘لينة’ مثل البوليمرات والجزيئات الحيوية. 5 التقنيات ذات الصلة باستخدام المسابر هندسيا مع قنوات لتوصيل السوائل، طرق مختلفة يشار إلى ‘نانوبيبيتيس’ و ‘نانو-نافورة الأقلام’، كما أفيد. 6 , 7 , 8

هو العقبة الرئيسية التي تعترض التطبيق الأوسع نطاقا للطباعة الحجرية المستمدة من الحركة الوطنية الصومالية الإنتاجية، كما أنه يتطلب وقتاً طويلاً مفرطة غير نمط سنتيمتر على نطاق المناطق مع إجراء تحقيق واحد. ركزت الجهود المبكرة لمعالجة هذه المسألة على الموازاة ل DPN ناتئ القائم، مع كل من ‘واحد-الأبعاد’ و ‘ثنائي الأبعاد’ التحقيق (2D) صفائف يتم الإبلاغ عنها للطباعة حجرية المناطق المتوسطة سنتيمتر. 5 , 9 ولكن هذه المصفوفات ناتئ يتم إنتاجها عن طريق أساليب تصنيع متعددة الخطوات معقدة نسبيا وهشة نسبيا. اختراع الطباعة الحجرية القلم البوليمر (PPL) تناولت هذه المسألة باستبدال cantilevers SPM القياسية مع صفيف ثنائي الأبعاد من المسابر الاستومر siloxane لينة المستعبدين إلى شريحة زجاج. 10 إعداد التحقيق البسيط هذا يقلل بشكل ملحوظ بتكلفة وتعقيد الزخرفة مساحات كبيرة، فتح نانوليثوجرافي لمجموعة واسعة من التطبيقات. كما تم توسيع هذه العمارة خالية ناتئ للثابت نصيحة الناعمة والربيع الطباعة الحجرية،11 الذي يوفر هجين للمساندة المرنة الناعمة مع نصائح السليكون الصلبة إعطاء القرار تحسن بالمقارنة مع الأنماط التي أنتجت باستخدام لينة نصائح الاستومر.

عاملاً حاسما في تنفيذ هذه التكنولوجيات صفيف ثنائي الأبعاد أن الصفيف التحقيق يجب أن تكون موازية تماما لسطح الركيزة حتى عند استخدام الطباعة الحجرية، جميع المسابر تتلامس مع السطح في وقت واحد. حتى اختلالها صغيرة يمكن أن يسبب فرقا كبيرا في حجم الميزة من جانب واحد من مجموعة إلى أخرى، نظراً لبعض التحقيقات سوف تأتي مع السطح في وقت سابق أثناء نزول الصفيف، بينما البعض الآخر سيدخل حيز الاتصال في وقت لاحق أو لا تعمل على الإطلاق. 12 المحاذاة الدقيقة مهم بشكل خاص مع شركته تنوي بسبب ديفورمابيليتي المسابر الاستومر الناعمة، حيث سيتم ضغطها المسابير الاتصال على السطح في وقت سابق، ترك بصمة كبيرة على السطح.

العمل في وقت مبكر في شركته تنوي توظيف التفتيش البصري البحت لتوجيه عملية المواءمة، باستخدام كاميرا محمولة فوق الصفيف لمراقبة تشوه المسابير هرمي كما نقلوا مع السطح. 10 كان يحكم بالمحاذاة بمراقبة أي جانب من المسابر جاءت مع السطح أولاً، ثم ضبط الزاوية وتكرار هذا الإجراء بصورة متكررة حتى كان الفرق في الاتصال على كل جانب من التحقيق لا يمكن تمييزها بالعين. كما يعتمد هذا الإجراء المحاذاة على ذاتي الفحص البصري بالمشغل، إمكانية تكرار نتائج منخفضة.

بعد ذلك، وضعت نهجاً أكثر موضوعية، تتألف من جهاز استشعار القوة الخيالة تحت الركيزة لقياس القوة المطبقة عند اتصال المسابر على السطح. 12 وهكذا تحقق المحاذاة عن طريق ضبط زوايا الميل تحقيق أقصى قدر من القوة التي تمارس، الذي أشار إلى أن جميع التحقيقات كانت في وقت واحد في جهة الاتصال. وأظهر هذا الأسلوب ممكن المحاذاة إلى داخل 0.004° الموازية السطحية. تم تنفيذ هذه ‘القوة ردود الفعل تمهيد’ الآن إلى أنظمة مؤتمتة بالكامل في تقريرين مستقلين. 13 , 14 استخدام مجموعة ثلاثية من أجهزة استشعار القوة الخيالة تحت الركيزة أو أعلاه الصفيف وقياس مقدار القوة التي تمارس عند الاتصال بين صفائف المجس والسطح. تعطي هذه الأنظمة عالية الدقة، الإبلاغ عن اختلالات ° ≤0.001 فوق نطاق طول 1 سم أو14 أو ≤ 0.0003 ° على 1.4 سم.13 كما توفر هذه النظم المؤتمتة المحاذاة الرئيسية تحقيق وفورات في عامل الوقت والوقت الإجمالي المستغرق لإكمال عملية الطباعة الحجرية.

تطبيق الرئيسية واحد من تلفيق السطح الفائق مكن من هذه التكنولوجيا هو جيل ركائز ثقافة الخلية. الآن ثبت هذا النمط الظاهري الخلية ويمكن التلاعب بها عن طريق التحكم بالتفاعل الأولى بين الخلايا والسمات السطحية، وأن هذا يمكن أن تتعزز في النانو. 15 على وجه التحديد، أساليب الطباعة الحجرية مسبار المسح قد أظهرت أن تكون طريقة سهلة لإنتاج مجموعة متنوعة من السطوح نانوفابريكاتيد لمثل هذه التجارب ثقافة الخلية. 16 على سبيل المثال، السطوح تقديم أنماط النانو مونولاييرس الذاتي تجميعها والمصفوفة خارج الخلية البروتينات templated بشركته تنوي و DPN قد استخدمت لدراسة إمكانية تعديل نانو المواد في المواد الناجمة عن التفريق بين الخلايا الجذعية. 17

ويصف هذا البروتوكول استعمال نظام المجهر (فؤاد) تعديل القوة الذرية التي تمكن شركته تنوي مساحة كبيرة. ونحن بالتفصيل في الكشف عن القوة باستخدام أجهزة استشعار متعددة القوة كوسيلة لتحديد الاتصال مسبار السطح، جنبا إلى جنب مع خوارزمية تقوم بأتمتة عملية تكرارية المحاذاة. ويرد الروغان اللاحقة لهذه الأنماط مع فيبرونيكتين البروتين المصفوفة خارج الخلية وثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة (همسك)، وإظهارا للأسطح ملفقة شركته تنوي تطبيقها لخلية ثقافة.

Protocol

1-تلفيق الصفيف القلم شركته تنوي لتحضير خليط كوبوليمر بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS): إضافة 10 ميليلتر من البلاتين (0)-1، 3-ديفينيل-1,1,3,3-تيتراميثيلديسيلوكساني حل معقدة و 172 ميليلتر من 1,3,5,7-ميثيل-1,3,5,7-تيترافينيلسيكلوتيتراسيلوكساني إلى 250 غرام من (7-8% w/w فينيلميثيلسيلوكساني)-ديميثيلسيلوكساني البوليمر المشارك. خلط هذه المكونات جيدا في خلاط دوارة لمدة 7 أيام لضمان خلط متجانس.تنبيه: البلاتين (0)-1، 3-ديفينيل-1,1,3,3-تيتراميثيلديسيلوكساني السامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. إضافة 0.5 غرام من (25-35% w/w ميثيلهيدروسيلوكساني)-بوليمر ديميثيلسيلوكساني المشارك بنسبة 1.7 غ من خليط من الخطوة 1.1.1 في وزنها القارب ومزيج دقيق مع ملعقة. ديغا هذا الخليط قبل نقلها إلى مجفف فراغ وتعريض الخليط إلى ضغط منخفض (متورر 200، 0.3 [مبر]) لمدة 20 دقيقة حتى تبدد جميع فقاعات الغاز. ثم ضع مكان شريحة زجاج 13 × 13 مم في قنينة بلاستيكية المسمار وتصدرت مليئة 20 مل 2-بروبانول، القنينة في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة لإزالة أي حطام كبيرة. يغسل الشرائح بغمر شرائح جديدة 2-بروبانول (100 مل) وجاف تحت تيار غاز النيتروجين. مكان سليكون سيد18 في طبق بتري قطرها 4 سم وإضافة كافية يطرد خليط PDMS prepolymer (من الخطوة 1، 1) حتى مغطاة بالكامل. عادة، مطلوب 100 ميليلتر لسيد 20 × 20 مم. مكان الرئيسية مع الخليط بريبوليمير في ديسيكاتور فراغ. ديغا البوليمر لدقيقة 5 أخرى لإزالة أي فقاعات الغاز تشكلت أثناء نقل الخليط. ينبغي إجراء معاملة البلازما2 س الشرائح الزجاجية (الخطوة 1، 4 أدناه) في حين جليحه تجري. التعامل مع مربعات زجاجية مع س2 بلازما (600 متورر) في الحد الأقصى من الطاقة الترددات اللاسلكية لمدة 1 دقيقة لإزالة أي التلوث العضوي وتوليد طبقة أكسيد موحدة على الزجاج للالتصاق الاستومر. 19 استخدام البلازما تعامل الشرائح على الفور في الخطوة التالية. بعناية مكان الشريحة الزجاجية مربعة (من الخطوة 1، 4) أكثر من بريبوليمير على الشريحة الرئيسية (من الخطوة 1، 3) مع الجانب تنظيف البلازما إلى الأسفل. اضغط برفق أسفل الشريحة الزجاجية على سيد السليكون لإزالة أي الهواء المحبوس وضمان فيلم موحدة من PDMS هو تقع بين سيد والشريحة. مكان الصفيف PDMS تقع فوق الخطوة في طبق بتري مع السيليكون ماجستير في الجزء السفلي (أي، مع الجزء الخلفي الشريحة الزجاجية التي تواجه صعودا) ووضع الطبق في فرن في 70−80 درجة مئوية ح 24−48 لعلاج حرارياً PDMS. إزالة الصفيف شُفي من الفرن والسماح لتبرد لمدة 15 دقيقة، ثم مع شفرة حلاقة بعناية إزالة أي PDMS الزائدة من الخلف والجانبين من الزجاج الشريحة واستخدام تيار نيتروجين الجاف لضربة بعيداً من أي حطام PDMS فضفاضة.ملاحظة: رعاية لا إلى الصفر سيد السليكون مع شفرة حلاقة، كما يجوز هذا الضرر غير عصا الطلاء. آسفين شفرة حلاقة في ركن الصفيف على عمق 1 مم ونقب بعناية الصفيف وبصرف النظر عن الشكل الرئيسي. تنفيذ هذا الإجراء في عمل رفع مستمر واحد؛ لا تسمح لمصفوفات للعودة إلى الشريحة الرئيسية. بعناية وقطع وكشط بعيداً من 0.5 مم PDMS على حواف الصفيف مع شفرة حلاقة. استخدام تيار نيتروجين الجاف لضربة بعيداً من أي حطام PDMS فضفاضة.ملاحظة: قد يكون أسهل القيام بهذه الخطوة التشذيب تحت ستيريوسكوبي أو عدسة مكبرة. رعاية لا إلى الصفر سيد السليكون مع شفرة حلاقة، كما يجوز هذا الضرر غير عصا الطلاء. 2-مجموعة إعداد وتركيب الركيزة إنشاء سطح ماء في الصفيف التحقيق قبل س2 بلازما العلاج: ضع الصفيف القلم شركته تنوي في طبق بتري في غرفة البلازما ثم تطبيق فراغ على متور 600. التبديل على مولد البلازما (إعداد الحد الأقصى) لمدة 30 ثانية. الإفراج عن الفراغ وإزالة الصفيف وتحقق لها هيدروفيليسيتي بإسقاط 20 ميليلتر من المياه إلى الصفيف، ومراقبة ما إذا كان هناك حتى نشر المياه عبر السطح. إذا لم يحدث ذلك، تخضع الصفيف لجولة ثانية من العلاج البلازما. وبعد ذلك، جاف الصفيف جيدا بتيار غاز النيتروجين الجاف. باستخدام الشريط الكربون على الوجهين، إرفاق الصفيف إلى منتصف صاحب التحقيق. جبل صاحب التحقيق على حامل فؤاد الحركية (الشكل 2). لتحميل الصفيف شركته تنوي مع حمض 16-ميركابتوهيكساديكانويك (مليون هكتار) (‘التحبير’): إعداد 16-ميركابتوهيكساديكانويك 1 ملم حمض (مليون هكتار) الحل بحل مغ 8.6 في الإيثانول 30 مل في أنبوب ووضعه في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة بالكامل حل المجمع.تنبيه: حمض 16-ميركابتوهيكساديكانويك السامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. استخدام ميكروبيبيتي، وإيداع 20 ميليلتر قطره من الحل مليون هكتار في الصفيف. تجنب اتصال نصائح ماصة مع الصفيف. تتيح له أن ينتشر في جميع أنحاء الصفيف، ثم السماح الإيثانول تتبخر في ظل الظروف المحيطة.ملاحظة: بدلاً من ذلك يمكن أن يتم التوقيع بعد المحاذاة الصفيف شركته تنوي. 10 مرة واحدة وقد جفت الحل مليون هكتار، جبل صاحب التحقيق مع الصفيف شركته تنوي على فؤاد. 3-إعداد ركائز الذهب لشركته تنوي. ركازات الذهب يمكن أما شراؤها، أو أدلى الداخلية الحرارية أو الإلكترون شعاع الترسيب، وهي التي شيدت من 2 نانومتر التيتانيوم التصاق طبقة تليها 20 نيوتن متر ذهب على رقاقة الزجاج أو السليكون. 18 حيثما كان ذلك ضروريا، بتنظيف ركائز بالأكسجين البلازما العلاج باستخدام المعلمات الموضحة في الخطوة 1، 4. ضع الركيزة الذهب في منتصف مرحلة عينة فؤاد وآمنة مع شريط لاصق حول حدود الركيزة (الشكل 2). ضبط المرحلة إلى الطول الصحيح كما هو مبين في تعليمات التشغيل الخاص بالشركة المصنعة باستخدام z-محور وحدة التحكم. 4-التلقائية محاذاة الصفيف القلم فتح وتشغيل وحدة تحكم المرحلة برنامج الإعداد (SetupNSF.exe) على جهاز الكمبيوتر لإعادة تعيين كافة المحاور (‘صفر’) وزوايا لمعايرة قبل نقطة الصفر، ثم استخدام المرحلة x/y-محور وحدة تحكم وحدة التحكم لنقل الركازة إلى المحاذاة المطلوبة/ موقع الطباعة. لتحقيق أفضل النتائج، ينبغي أن توضع الركيزة قرب وسط المسرح، بين أجهزة استشعار القوة المرحلة.ملاحظة: في بعض النماذج من الكمبيوتر, x/y-محور وحدة تحكم USB إشارة قد تتداخل مع ذلك من z-محور وحدة التحكم. في حالة حدوث ذلك، قم بفصل x/y-محور وحدة تحكم USB كابل بعد هذه الخطوة. يجب ثم إعادة الاتصال بعد إجراء المحاذاة (الخطوة 4، 7). التبديل المرحلة ذراع التحرير للإفراج عن مرحلة عينة وتنشيط ثالوث مجسات القوة كما هو مبين بإرشادات الشركة المصنعة فؤاد. السماح أجهزة استشعار قوة حجته لمدة 15 دقيقة على الأقل. لتحقيق أفضل النتائج، تتيح 30-50 دقيقة. زيادة ارتفاع محور ع لإحضار الصفيف إلى التقارب الوثيق مع الركيزة عن طريق مراقبة بصريا من الصفيف المجس والسطح.ملاحظة: كلما اقتربت الصفيف إلى السطح، تكرارات أقل مطلوبة من أجل عملية المحاذاة، مما يوفر الوقت. فتح/تشغيل البرنامج “التلقائي المحاذاة” (محاذاة السيارات v16.exe) وإدخال المعلمات محاذاة ذات الصلة إلى البرنامج. أدخل قيمة المعلمة المطلوب ‘”زاوية الخطوة”‘، عادة 0.15°. هذه المعلمة هي زاوية الإزاحة من زاوية ‘الأمثل’ لكل محور يتم تحديده بواسطة البرنامج. تعيين هذه المعلمة بين 0.1 و 0.2 درجة، كما لا تؤدي فرق قوة وضوح قابلة للكشف على نهج تحقيقات زوايا أقل من هذا النطاق إلى السطح.ملاحظة: البرنامج يقبل قيم في ميليديجريس (أي، 1 x 10-3 °). على سبيل المثال، لدرجة 0.15، ينبغي إدخال المستخدمين ‘150’. إدخال “خطوة الخشنة” المطلوب ‘ قيمة المعلمة، وعادة 0.6 ميكرومتر. هذه المعلمة هو حجم الخطوة محور ع المستخدمة من قبل المرحلة وهي تقترب من التحقيقات في محاذاة الخام الأولية. تعيين هذه المعلمة بين 0.2 و 1 ميكرومتر. أكبر خطوة أحجام تخفيض الوقت الذي تستغرقه عملية المحاذاة ولكن تقليل دقة المحاذاة، وزيادة ارتداء التحقيقات.ملاحظة: البرنامج يقبل قيم خطوات الخشنة في ميكرومتر. على سبيل المثال، عن 0.6 ميكرومتر ينبغي إدخال المستخدمين ‘0.6’. قم بإدخال قيمة المعلمة ‘”غرامة الخطوة”‘ المرجوة، عادة 0.2 ميكرون. هذه المعلمة هو حجم الخطوة محور ع المستخدمة لتسوية غرامة المحاذاة المثلى. لمعظم التطبيقات، تعيين هذه المعلمة بين 0.1 و 0.4 ميكرومتر. أكبر قيمة الخطوة أحجام سوف إنقاص مقدار الوقت اللازم لعملية المحاذاة ولكن يقلل من جودة المحاذاة.ملاحظة: البرنامج يقبل قيم خطوات الدقيقة في ميكرومتر. على سبيل المثال، عن 0.2 ميكرومتر، ينبغي إدخال المستخدمين ‘0.2.’ تكوين ‘مسار ملف Excel’ وإرفاق نسخة غير معدلة من ملف قالب ورقة العمل المقدمة باستخدام الرمز ‘مجلد’ والانتقال إلى موقع الملف، والضغط على ‘موافق’. يحتوي هذا الملف على البيانات الخام والمحسوبة التي تستخدم لتحديد زوايا الميل المرحلة المثلى للمرحلة. فتح/تشغيل برامج التحكم فؤاد. انتقل إلى عنصر التحليل الطيفي لهذا البرنامج بواسطة النقر فوق الزر ‘أطياف’ (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة)، وتعيين فؤاد فحص محور ع الرأس يتذبذب من 10 ميكرون ما يزيد على 100 مللي ثانية، مع وقت الإيقاف مؤقت من 250 مللي ثانية، ثم 10 ميكرون بسحب ما يزيد على 100 مللي مع وقت الإيقاف مؤقت من 250 مللي ثانية (الشكل 3). كما فؤاد هو تتأرجح الرأس، انقر فوق الزر ‘ابدأ’ من برنامج المحاذاة للبدء في عملية المحاذاة التلقائية. عند تشغيل البرنامج، البرنامج كتابة وقراءة البيانات الموجودة في الملف الموضحة في الخطوة 4.4.4.ملاحظة: يأخذ المحاذاة بين 30 دقيقة و 3 ح تبعاً لموقف المرحلة الأولية المحددة في الخطوة 4، 3 وتكوين البرامج التي تم إدخالها في الخطوة 4، 4.تنبيه: وحدات تحكم المرحلة ما تزال نشطة أثناء عملية المحاذاة-عدم استخدامها أثناء عملية المحاذاة في أنها سوف تتداخل مع المحاذاة. عندما ينتهي المحاذاة، ستضيء مربع الضوء الأخضر ‘”الانتهاء من محاذاة”‘ على برنامج المحاذاة (من الخطوة 4، 4). عند حدوث ذلك، انقر فوق الزر ‘إيقاف’ في واجهة المستخدم لإنهاء عملية المحاذاة. فحص الرسوم البيانية في ملف قالب جدول البيانات لوجود ترابط بين نقاط البيانات المسجلة والخط تناسب الذي تم إنشاؤه بواسطة البرنامج. راجع نتائج تمثيلية للحصول على أمثلة لعلاقة جيدة، مع آر2 القيم النموذجية > 0.99. إذا لم ينجح المحاذاة، استبدال الصفيف التحقيق مع مجموعة أعدت حديثا (الخطوة 2) وتكرار المحاذاة (الخطوة 4، 4). التحرك المرحلة صعودا في z-محور باستخدام وحدة تحكم المرحلة لهذا المحور. ينبغي أن تنقل المرحلة 500 نانومتر زيادات حتى يمكن ملاحظة جهة الاتصال من الكاميرا عرض أعلى من فؤاد. الاتصال بين المصفوفة والركيزة يمكن ملاحظتها كنقطة بيضاء ‘ من التباين العالي على قمة الأهرامات مسبار الفردية. عند هذه النقطة، انقر فوق الزر ‘إيقاف’ على برامج التحكم فؤاد لإيقاف برنامج التحليل الطيفي من الخطوة 4، 5. هذا وسوف تتراجع الصفيف قبل 10 ميكرومتر، ولذلك ترك 10 ميكرون من امتداد محور ع ممكن. التحقق من الصورة من الكاميرا عرض أعلى من فؤاد لضمان أن المسابير ليست على اتصال مع الركازة. 5-بوليمر القلم الطباعة الحجرية (PPL) انتقل إلى عنصر الطباعة الحجرية في برامج التحكم عن طريق النقر فوق الزر ‘الطباعة الحجرية’ على برنامج حاسوبي لمراقبة. اختر z-تعديل وضع التشغيل واستيراد من خطوط المسح (صورة نقطية) أو ناقلات الصورة التي سيتم استخدامها كنمط الطباعة الحجرية. من أجل توليد الميزات سيظهر في نتائج تمثيلية، استخدام صورة نقطية تتألف 20 x 20 أسود بكسل (انظر مواد تكميلية)، المقابلة للطباعة الحجرية لشبكة النقاط 20 × 20 في التحقيق في الصفيف شركته تنوي. أدخل المعلمات الطباعة الحجرية في نافذة ‘”استيراد الرسومات بكسل”‘ البرمجيات تحكم فؤاد. تكوين ‘حجم’ نمط توليد، مثلاً، 40 ميكرومتر في الطول والعرض. هذه المعلمات تشير إلى العرض والطول الذي سيتم تحجيم الصورة في الصورة النقطية. لإنشاء ميزات سيظهر في نتائج تمثيلية، استخدم عرض وطول 40 ميكرومتر في كلا البعدين. تعيين ‘الأصل’ من النمط إلى يتم إنشاؤها في 25 ميكرومتر على المحور x و y . تحديد هذه المعلمات وسط الصورة بالنسبة لمركز فؤاد x/y-محاور. قم بتعيين هذه المعلمات تجنب منطقة السطح فيها إجراء تحقيقات في الاتصال أثناء عملية المحاذاة. تعيين طباعة ‘المعلمات’. هذه القيم تحدد كيف يتم التحقيقات تمديد (جلب أي اتصال مع السطح) استجابة لكل بكسل في الصورة النقطية. حدد من القائمة المنسدلة ‘”تعديل إس Z نقاط البيع”‘ و ‘تبسيط إلى’ طبقتين. يرشد هذا الوضع فؤاد تمديد المسابير بوضع مسافة مطلقة يحددها نتائج اثنين فقط، أما ‘الأسود (0)’ أو ‘الأبيض (1)’ الحقول. تعيين القيم في حقول ‘الأبيض (1)’ ‘الأسود (0)’ وإلى 5 و-5 ميكرومتر، على التوالي. هذه القيم تحدد المسافة التي ينبغي أن تنقل التحقيقات في الاستجابة إلى بكسل سوداء أو بيضاء في الصورة النقطية ويتم عادة تعيين بين 3 و 5 ميكرون ل ‘الأسود’ (أيتمديد المسابير نازلا بتلك المسافة بالنسبة لنقطة الصفر في هذا المحور) و-3 إلى-5 ميكرومتر ل ‘الأبيض’ (أي، سحب المسابير صعودا من 3 إلى 5 ميكرومتر بالنسبة لنقطة الصفر).ملاحظة: تفترض هذه المسافات الممثل أن نتائج ملحق 5 ميكرومتر في تحقيقات ملامسة السطح ومن ثم توليد ميزة، بينما سحب 5 ميكرومتر المصاعد المسابير بعيداً عن السطح أسفر عن أي اتصال. ض-ملحق يؤثر على حجم الميزة بتحديد مدى اتصال التحقيق مع النتيجة ملحقات السطحية، وزيادة في تحقيقات ضغوط أخرى إلى السطح، وأسفر عن ميزات أكبر. 10 انقر فوق الزر ‘موافق’ لتطبيق هذه الإعدادات وإغلاق النافذة. أدخل ‘وقت الإيقاف المؤقت’ في إطار الطباعة الحجرية فؤاد برمجيات التحكم، عادة 1 s. يحدد هذا الإعداد طول الوقت التحقيقات لا تزال في موقف ‘الأسود’ الموسعة، التي عادة ما يتم تعيين بين 0.1 و 10 s.ملاحظة: يؤدي أوقات أطول في وقفه في أحجام أكبر ميزة نظراً لكمية أكبر من مليون هكتار المنقولة إلى السطح الذهب. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول التحكم في حجم المزايا المتولدة في تقارير أخرى. 20 إعداد ضميمة مراقبة الغلاف الجوي. انخفاض في دائرة العزلة الغلاف الجوي على فؤاد وفتح/تشغيل البرنامج المتوفر من قبل الشركة المصنعة لمراقبة الغلاف الجوي (MHG_control.exe). تعيين برنامج مراقبة الغلاف الجوي للحفاظ على رطوبة النسبية 45% ودرجة حرارة 25 درجة مئوية، وتبادل جو ‘معدل التدفق’ 500 مل بإدخال هذه القيم في البرنامج. انقر فوق ‘استخدام’ لتطبيق الإعدادات. وحدة مراقبة الغلاف الجوي ثم يبدأ بضخ الهواء هوميديفيد في الدائرة.ملاحظة: يؤدي ارتفاع مستويات الرطوبة في أحجام أكبر ميزة بسبب تشكيل غضروف المياه أكبر إنشاء صفائف القلم بين سطح. 21 تعيين هذه القيمة عادة ما بين 40 و 60 في المائة. يتم عادة تعيين معدل تدفق بين 300 و 500 مل. تدفقات أكبر يسمح مستوى الرطوبة المطلوبة التوصل إلى أكثر سرعة ولكن أقل دقة. نتائج تمثيلية استخدام معدل تدفق 500 مل للجيل الأول من الرطوبة وانخفض إلى 300 مل عند الوصول إلى الرطوبة المطلوبة، للحفاظ على مستوى دقة ومستقرة أثناء الطباعة الحجرية. حالما يتم الحصول على الرطوبة المرغوبة، بدء تسلسل معدني بالضغط على زر ‘ابدأ’ في واجهة البرنامج. عند الانتهاء من الطباعة الحجرية، استخدم وحدة تحكم المرحلة محور ع لنقل الركازة بعيداً عن الصفيف بتراجعه في المرحلة قبل 500 ميكرومتر. قم بإزالة غرفة العزلة الغلاف الجوي من جبل. التبديل ذراع المرحلة تأمين مرحلة عينة وتنشيط أجهزة الاستشعار، والقوة كما هو مبين بإرشادات الشركة المصنعة فؤاد، ثم إزالة الركيزة من المرحلة. 6-نمط التصور أنماط يمكن تصور استخدام إحدى الطرق التالية، والوحشي فرقة المسح النقش المسبار المجهري أو الكيميائية. مسح السطح منقوشة على فؤاد مع وضع القوة الجانبية باستخدام وضع الاتصال ناتئ لدراسة الميزات غير بشكل هدام.ملاحظة: يمكن استخدام مجهر القوة الجانبية كأسلوب غير تدميري لعرض الميزات التي تنتجها البوليمر القلم الطباعة الحجرية؛ ومع ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، يمكن فقط مساحة صغيرة نسبيا تصور (عادة 100 × 100 ميكرومتر). حيث يمكن أن تعمل مليون هكتار المودعة كمقاومة أحفر، يمكن استخدام النقش الكيميائية لإزالة الذهب من المناطق غير منقوشة. ثم يمكن تصور مجالات أونيتشيد الناتجة من الفحص المجهري الضوئية، مما يعني مساحة واسعة يمكن عرضها في وقت واحد. 18ملاحظة: لا يمكن استخدام ركائز هي محفوراً في هذا الطريق ثم لتجارب الثقافة الخلية التالية المبينة أدناه. كل على حدة، إعداد المحاليل من ال 40 مم، ونترات الحديد الثلاثي 27 ملم، وحمض الهيدروكلوريك 100 مم. إعداد تنميش واسطة خلط 5 مل من كل واحد من هذه الحلول الثلاثة. مزيج طازجة قبل كل استعمال. 22تنبيه: ال، ونترات الحديد الثلاثي، وحمض الهيدروكلوريك مواد سامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. نقل الركازة منقوشة في طبق بتري وماصة تنميش حلاً كافياً في الطبق لتغطية سطح الركازة (عادة 10 مل). يبقى الركيزة المغمورة لمدة 4-5 دقائق حفر 15 نانومتر ذهب (بمعدل تقريبي 3 نيوتن متر/دقيقة). عندما يتم الانتهاء من النقش، إزالة الركيزة وشطف جيدا بالماء وجاف مع تيار نيتروجين.ملاحظة: الانتهاء من عملية النقش يتحدد سمك الذهب السطحية التي تم الحصول عليها (الخطوة 3.1) المرتبطة بمعدل النقش المحدد (الخطوة 6.2.2). تفقد ميزات الذهب المحفور تحت مجهرية بصرية حقل مشرق. يجب أن تظهر ملامح الذهب المتبقية التي ما زالت المقابلة للنمط الذي تمت طباعته (من الخطوة 5، 2). إذا كامل السطح تظهر متجانسة، وهذا يشير إلى أن تبقى كمية كبيرة من الذهب، ويجب تكرار الخطوة النقش (الخطوة التالية 6.2.2) لمدة 1-2 دقيقة. 7-نمط الروغان مع فيبرونيكتين تزج ركائز منقوشة في إيجاد حل لحل hexa(ethylene glycol) 1 مم (11-ميركابتونديسيل) في الإيثانول حاء 1 يغسل الركيزة ثلاث مرات مع الإيثانول وتجف تماما تحت تيار نيتروجين. هذه الخطوة باسيفاتيس مجالات الذهب أونباتيرنيد.تنبيه: hexa(ethylene glycol) (11-ميركابتونديسيل) السامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. تغرق ركائز في 10 مم2 Co (لا3) محلول مائي لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، إزالة ركائز من الحل، أغسل ثلاث مرات بالماء عالي النقاوة والجافة تحت تيار نيتروجين الجاف.تنبيه: أول أكسيد الكربون (لا3)2 السامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. تزج الركيزة في محلول 50 ميكروغرام/ملليلتر من فيبرونيكتين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) واحتضان في 4 درجات مئوية عن 16 حاء يغسل الركيزة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم الجاف الركيزة تحت تيار نيتروجين الجاف.ملاحظة: فيبرونيكتين منضماً إلى المناطق فونكتيوناليزيد مليون هكتار من خلال عملية إزالة معدن ثقيل Co(II) المجموعات الطرفية الكربوكسيلية الحمضية على مليون هكتار. ثم يربط فيبرونيكتين إلى Co(II) عبر المجال الكولاجين-ملزمة به. 23 إذا رغبت في ذلك، تصور فيبرونيكتين سطح زمنياً بوضع العلامات عليه مع الأجسام المضادة الفلورسنت: تطبيق حل 2 مل من 1: 100 أرنب unconjugated المضادة-فيبرونيكتين جسم الأولية في 5% (w/v) من ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني على السطح واحتضان في 4 درجات مئوية عن 16 h. أسبيراتي المادة طافية وتغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. تغرق الركيزة في حل 2 مل من فلوريسسينتلي مترافق أرنب المضادة الأجسام المضادة الثانوية (في المحددة تمييع الشركة المصنعة، 2 قطرات/mL) في 5% (w/v) لجيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، وتغطي برقائق القصدير واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 1 h. أسبيراتي المادة طافية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. سجل تعيين الصور مجهرية ابيفلوريسسينسي من ميزات استخدام مجهر الأسفار وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، مع عامل تصفية إثارة إلى 594 شمال البحر الأبيض المتوسط. 8-خلية ثقافة على السطوح نانوفابريكاتيد إعداد تعليق تتميز أيضا همسكس التي بين 4th ومرورال 6. 24 تعليق قارورة المتلاقية من الخلايا قبل الشطف مرة واحدة مع 10 مل برنامج تلفزيوني، وفصل الخلايا التقيد بها بإضافة 5 مل من التربسين/أدتا إلى قارورة زراعة الأنسجة T75 واحتضان قارورة في دائرة هوميديفيد في 37 درجة مئوية وتستكمل مع 5% CO2 لمدة تصل إلى 5 دقائق حتى س 90% يتم فصل الخلايا و من سطح الأرض. بعد ذلك إضافة 6 مل الطازجة ثقافة الوسائط التي تحتوي على 10% مصل العجل الجنين (FCS) في قارورة وشطف بإيجاز في قارورة مع وسائل الإعلام وأضاف. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 غرام عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة. حساب كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير25 وضبط كثافة تعليق الخلية إلى 2 × 104 خلايا/مل بإضافة وحدة تخزين مناسبة للثقافة الإعلامية. بذور الخلايا على ركائز في كثافة 104 خلايا/سم2. قص الركيزة إلى 1 × 1 سم2 مع الكاتب الماس ووضعه في بئر في لوحة زراعة الأنسجة 12-جيدا. “الماصة؛” 2 مل تعليق خلية في ثقافة وسائل الإعلام (من الخطوة 8.1.4) في البئر واحتضان في دائرة هوميديفيد في 37 درجة مئوية وتستكمل مع 5% CO2 ل 24 ساعة. بعد نمو الخلايا على الأنماط، تحليل مدى مرفق الخلية وينتشر بها الفلورة: قم بإزالة الوسائط وتغسل ركائز مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع 2 مل حل بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة في غطاء الدخان ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.تنبيه: بارافورمالدهيد السامة. الرجاء قراءة العظمية قبل العمل بهذا الحل. يجب ارتداء معدات السلامة أثناء التعامل مع المواد الكيميائية. بيرميبيليزي الخلايا مع 2 مل من إيجاد حل للمنظفات 0.5% (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. غمر الركيزة في 2 مل من إيجاد حل لأرنب unconjugated المضادة-فيبرونيكتين جسم الأولية في التخفيف من 1: 100 مع 5% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني واحتضان في 4 درجات مئوية عن ح 16، ثم يغسل ثلاث مرات مع 0.1% (v/v) 20 توين في “برنامج تلفزيوني” (ببست). بعد ذلك تغرق الركيزة في 2 مل من إيجاد حل لأرنب المضادة مترافق فلوريسسينتلي جسم الثانوي (المخفف بنسبة 5% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني في تمييع المحدد الخاص بالشركة المصنعة، 2 قطرات مليلتر) وتغطي برقائق القصدير واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1، ثم تغسل ثلاث مرات مع 0.1% ببست. لتسمية خيوط الأكتين، غمر 2 مل فالويدين فلوريسسينتلي مترافق في إضعاف 1: 250 في برنامج تلفزيوني، وتغطي برقائق القصدير واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. وفي الوقت نفسه وصمة عار نواة الخلية جبل الركيزة بتطبيق قطره من تصاعد DAPI تحتوي على المتوسط، وتغطي مع ساترة. تصور الخلايا باستخدام مجهر الأسفار وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، مع عوامل الإثارة من 365 نانومتر لنوى (DAPI)، 488 نانومتر واكتين و 594 نانومتر فيبرونيكتين.

Representative Results

للتحقق من ما إذا كانت المحاذاة التلقائية كانت ناجحة، وتم فحص الرسوم البيانية المرسومة من محاذاة البيانات (في جدول البيانات من الخطوة 4، 8). حيث نجحت عملية المحاذاة وقطعتي، المقابل للزاوية التي قد تم يميل مرحلة عينة على طول محاور θ و φ، أظهرت سلسلة من ارتفاع وتنازلي نقاط البيانات. في كل من المؤامرات، أظهرت يناسب خطي اثنين من نقاط البيانات تقاطع واضحة المعالم “الذروة” تشير إلى الحد الأقصى z-تحقيق الإرشاد والزاوية المقابلة التي تمت محاذاة (الشكل 4A و 4B). هذه العملية يتم تكرار أربع مرات (أي، مرتين لكل محور) ورسم كمجموعة من الإحداثيات الأربعة. وهكذا يبين التقاطع بين كل زوج من الإحداثيات الزوايا عموما الأمثل (الشكل 4). 13 وفي الحالات التي لم تكن ناجحة حيث المحاذاة، يمكن ملاحظة أن θ المقابلة، وقطع الزاوية φ لا تعطي يناسب خطية ذات نوعية جيدة، أو لا تتقاطع (الشكل 5). عادة ما تكون مثل هذه التحالفات الفاشلة نتيجة صفائف يجري اقتطاعها خاطئ أو المركبة لصاحب التحقيق (الخطوات 1.7 و 1.8 و 2.2). وفي هذه الحالات، تم إهمالها في الصفيف وواحدة جديدة أعدت وشنت (الخطوات 1 و 2)، وتكرار عملية المحاذاة (الخطوة 4). عند محاذاة ناجحة والطباعة الحجرية مع وزير الشئون الداخلية بشركته تنوي، كانت منقوشة ركائز الذهب ثم تصويرها استخدام مجهر القوة الجانبية لفحص ما إذا كانت قد جرت ترسب. كما أجرى دراسة مجال أكبر للسطوح المطبوعة مجهرية ضوئية لركائز بعد النقش بالذهب لا يحميها ثيول المودعة (رقم 6 و رقم 7). ومع ذلك، أنماط محفوراً لا يمكن استخدامها لمزيد من الروغان، ويجب استخدامه فقط لتأكيد الزخرفة على عينات تمثيلية من دفعة ركائز السطح المطبوع. إذا كان إظهار أنماط محفوراً فارغة المناطق المقابلة لكل الأقلام (الشكل 8)، يشير إلى هذه النتيجة أن إنتاج صفائف التحقيق لا قد أنجز بنجاح، وأن بعض التحقيقات معطوباً أو مفقوداً. هذا إينهوموجينيتي التحقيقات قد يكون بسبب استخدام ماجستير القديمة حيث طلاء الفلور والباليه بعيداً (الخطوة 1، 3)، نتج عنه بعض المسابير تمزقها بعيداً عندما يتم فصل الصفيف من سيد. وفي هذه الحالات، ينبغي أن تستخدم رئيسية جديدة. قد تكون النتيجة أيضا بسبب وجود الهواء فقاعات محاصرين بين الزجاج النسخ وسيد (الخطوة 1.5)، أو إذا كان الصفيف التحقيق لا فصل نظيفة من سيد بعد علاج (الخطوة 1.8). جمع صور مجهرية الفلورسنت الأسطح فيبرونيكتين فونكتيوناليزيد همسكس المحتضنة كانت أيضا (الشكل 9). وبصفة عامة، كل ركائز كانت مستقرة داخل بيئة الثقافة في المختبر والخلايا التقيد بها وتكييفها على مورفولوجيا إلى النقوش المطبوعة في حالة أصغر معزولة 20 x 20 مجموعة من الميزات. رقم 1. التمثيل التخطيطي للطباعة الحجرية القلم البوليمر عرض الحبر الجزيئية النقل عبر غضروف مياه على نصيحة مسبار. (أ) الجانب الشخصي وعرض (ب) أعلى من الصفيف القلم البوليمر تشير إلى أن عند محاذاة الصفيف المجس وسطح الركازة تماما جميع المسابر تتلامس مع السطح في نفس الوقت، أسفر عن الطباعة الحجرية المتوازية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2. رسم تخطيطي للطباعة الحجرية القلم البوليمر تعيين المكياج. (أ) عرض الجانب توسيع نطاق مجموعة تجريبية تصل فيها يعلق على التحقيق حامل الصفيف مسبار المعدة والتي شنت على الماسح الضوئي فؤاد. الركيزة يوضع على المسرح، أدناه التي تقع قوة الثلاثة أجهزة الاستشعار. (ب) تمثيل للأجهزة المجمعة، عرض رئيس المسح الضوئي فؤاد بالنسبة إلى مرحلة عينة. (ج) أسفل طريقة العرض يظهر قوة استشعار الموقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3. التمثيل التخطيطي يصور برنامج التحليل الطيفي لإجراء محاذاة. يتم تعيين الماسح الضوئي فؤاد لتحريك المسابير تجاه عينة بمسافة 10 ميكرون داخل 100 مللي ثانية، المعقود في موقف 250 مللي ثانية، متبوعاً سحب 10 ميكرون داخل 100 مللي ثانية، وثم عقد ل ms 250 في موقف تراجع. ثم يتم تكرار الحركة طوال عملية المحاذاة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4. الرسوم البيانية التي توضح محاذاة ناجحة. الرسوم البيانية لموقف z ضد زوايا الميل (A) θ و (ب) φ لمحاذاة نجاح، حيث تشير ● قياس القيم الفعلية و + يشير إلى الأفضل يتناسب مع طريقة المربعات الصغرى. (ج) الرسم البياني ل φ ضد θ مزودة الزوايا مع النقاط الأربع حيث تم التوصل إلى z-موقف الحد الأقصى. نقطة تقاطع ملحوظ هو زاوية الميل المثلى النهائي عبر محاور على حد سواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 5. الرسوم البيانية التي توضح محاذاة غير ناجحة- الرسوم البيانية للموقف z ضد زوايا الميل (A) θ و (ب) φ لمحاذاة غير ناجحة، حيث تشير ● قياس القيم الفعلية و + يشير إلى الأفضل يتناسب مع طريقة المربعات الصغرى. (ج) الرسم البياني ل φ ضد θ مزودة الزوايا مع النقاط الأربع حيث تم التوصل إلى z-موقف الحد الأقصى. لا اوبتيما واضحة أو مراعاة نقطة تقاطع ولذلك لم يتم حلها بزوايا المحاذاة المثلى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 6. المجهر الضوئي توضيحية وصور مجهرية القوة الذرية من ركائز الذهب التي كانت منقوشة مع وزير الشئون الداخلية من صفائف شركته تنوي الانحياز وثم محفوراً. (أ) و (ب) صور مجهرية ضوئية تضخيم تسلسلياً محفوراً إلى الأنماط؛ (ج) صورة شبكة واحدة من أنماط طبوغرافية فؤاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 7. صور المجهر الضوئي توضيحية من ركائز الذهب التي كانت منقوشة مع وزير الشئون الداخلية من صفائف شركته تنوي الانحياز وثم محفوراً. (أ) و (ب) صور مجهرية ضوئية تضخيم تسلسلياً محفوراً أنماط و (ج) صورة تكبير أقل مساحة كبيرة وتبين أنماط متجانسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 8. صورة توضيحية المجهر الضوئي من الركازة الذهب التي كانت منقوشة غير متكافئ مع وزير الشئون الداخلية وثم محفوراً. تم تكرار أنماط المقصود (تظهر اقحم) شبكات خطوط دوت 20 مرتبة في خطوط 20، مع كل اثنين من خطوط إنتاجها بزيادة ض-تمديد المحور 1 ميكرومتر (تتراوح 5-5 ميكرومتر). ويمكن النظر إلى أن في بعض المناطق لا أنماط يتم إنشاؤها، بسبب تحقيقات مفقودة في تلك المواقع. في المناطق التي تنتج فيها سطرين فقط من النقاط، تشير هذه النتيجة إلى أن تحقيق موجود ولكن ليس من نفس الارتفاع كمجسات تعمل بكامل طاقتها، حيث يتميز بإيداع فقط عندما يتم توسيع الصفيف ب الكامل z-محور المسافة. في هذه الصورة، تم تغيير التباين عمدا لتمكين مراقبة المجالات المطبوعة جزئيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 9. صور مجهرية ابيفلوريسسينسي همسكس مثقف على صفائف فيبرونيكتين templated بشركته تنوي- (A) و (ب) هي صور عالية التكبير تظهر الخلايا الفردية. (ج) يظهر نمط مثال الصفيف فيبرونيكتين دون ملتصقة الخلية، و (د) هو صورة ميدانية واسعة من الخلايا المزروعة في ترتيب شبكة (تخطيطي للنقش المطبوع يرد أيضا في البطانة). الخلايا ملطخة بإظهار فيبرونيكتين (أحمر)، واكتين (الأخضر) وخلية نوى (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

يخدم هذا البروتوكول تزويد المستخدمين بمنهجية ملائمة للقيام بسرعة نانوليثوجرافيك الزخرفة مع التوحيد عالية وحجم الميزة يمكن السيطرة عليها على مدى كبير مناطق (سم2). يمكن كذلك ثم وضع ركائز تحمل هذه نانوباتيرنس مساحة كبيرة لمجموعة متنوعة من التطبيقات. تطبيق رئيسي واحد من هذه التكنولوجيا في توليد الأسطح نانوفابريكاتيد لدراسات التفاعل سطح الخلية. يظهر هذا التقرير بعض الأمثلة التوضيحية لثقافة الخلية على هذه المواد، مما يدل على سيطرة مورفولوجيا همسك من ركائز نانوفابريكاتيد.

التمكين الرئيسية من هذا البروتوكول هو أتمتة عملية المحاذاة (الخطوة 4) يتيح إنتاج موحدة للغاية والفائق من الميزات على السطوح، وصولاً إلى القرار النانو، الذي يتيح للدوران السريع لتجارب الثقافة الخلية. الطباعة الحجرية القلم البوليمر نفذت باستخدام هذه الخوارزمية المحاذاة قادرة على توليد ميزات النانو داخل حوالي 30 دقيقة. إمكانية تكرار نتائج ودقة المحاذاة التلقائية، ومن ثم توحيد ملامح منقوشة، هو حاسمة تعتمد على نوعية صفيفات التحقيق التي يتم إنتاجها (الخطوة 1 و 2). أي عيوب في إعدادها أن تسفر تحقيقات غير حادة أو كسر أو مفقودة؛ مثل الهواء المحبوس فقاعات (الخطوة 1.5) أو فصل غير لائق التحقيقات عن سيد (الخطوة 1.8) قد يتسبب في محاذاة غير دقيقة ورداءة نوعية الطباعة الحجرية.

وهذا عن أسلوب سهم تحديد القواسم المشتركة مع أساليب أخرى المحاذاة التي تعتمد على قوة التغذية المرتدة. تحديد دقة عندما المسابير على اتصال بالسطح مقيد بالحاجة إلى مراعاة للخلفية الاهتزازات الناجمة عن البيئة المحيطة وحركة المسرح عينة. وبصفة عامة، أجهزة الاستشعار لديها حساسية قوة في نظام µN (µN 2 في هذه الحالة)، ولكن تم تصميم خوارزمية المحاذاة فقط تسجيل قوة µN على الأقل 490 كجهة اتصال نهائياً بين التحقيقات والسطح، وتفاديا لأي رسول ‘المغلوطة’ تينغ من ضجيج الخلفية. 13 هكذا، هذا الأسلوب يميل إلى إنتاج ميزات كبيرة (1-2 ميكرومتر) منذ التحقيقات يجب تمديد مسافة كبيرة على z-المحور (مع ما يترتب عليها من قوة أعلى) من أجل سجل جهة اتصال. بغية التعويض، يمكن إنشاء ميزات أصغر بتقليل z-سافر مسافة المحور أثناء الخطوة الطباعة الحجرية (مثلاً، إدخال الإعداد ‘الأسود’ في الخطوة 5.2.3.2 ميكرومتر 3 بدلاً من 5 ميكرومتر).

ومع ذلك، حتى مع هذا القيد، أتمتة الخوارزمية قادرة على معالجة أحد جوانب البالغة الأهمية في تطبيق أساليب الطباعة الحجرية مسبار المتوازية المسح، مثلما كانت محاذاة معظم الوقت صعبة وغير دقيقة الخطوة في تنفيذ هذه التقنيات. التحولات أتمتة هذا الآن خطوة الحد من معدل عملية التصنيع من المحاذاة لكتابة معدني نفسها. بينما يوضح هذا البروتوكول تطبيق هذا الإجراء المحاذاة لشركته تنوي، الإطار يمكن أن تطبق على عدد من التقنيات SPL مثل دهن DPN26 والطباعة الحجرية المصفوفة مساعدة27 ، فضلا عن المستقبل المحتملين الحافز نظم التحقيق. 28

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب الاعتراف بدعم مالي من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك في المملكة المتحدة الهندسة ومجلس بحوث العلوم الفيزيائية (منح الحكام. EP/K011685/1، والجيش الشعبي/K024485/1) ومنحة الدراسات عليا لجابر؛ الثقة Leverhulme (آر بي جي-2014-292)؛ صندوق دعم الاستراتيجية المؤسسية ويلكوم ترست (105610/Z/14/Z)؛ المجلس الثقافي البريطاني (216196834)؛ وجامعة مانشستر لجامعة مانشستر معهد البحوث (عمري مضخة فتيلة الصندوق) و “منحة الدكتوراه الرئاسية” للمساعدة التقنية مقصدين من الدكتور أندرياس ليب (نانوسورف AG) هو أيضا العرفان.

Materials

Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. “Dip-Pen” Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. “Force-Feedback” Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. “Multipoint Force Feedback” Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in “Dip Pen Nanolithography”. Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. . Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).

Tags

Large-area Scanning Probe NanolithographyAutomated AlignmentSubstrate FabricationCell Culture StudiesPDMS PrepolymerSilicon MasterPPL ArrayOxygen Plasma TreatmentAFM Lithography

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, I., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image