מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא
Summary
טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.
Abstract
מטרת טכניקה זו היא לספק תהליך עקבי, מדויק, הניתנים לניהול והגמישים עבור מספרים גדולים של מדידות קפסולה רב-סוכר.
ראשית, תמונת הסף נוצר בהתבסס על ערכי העוצמה מחושב באופן ייחודי עבור כל תמונה. לאחר מכן, עיגולים מזוהים בהתבסס על הניגוד בין אובייקט לבין רקע בעזרת האלגוריתם מעגל האף טרנספורמציה (CHT) ומבוססת. לבסוף, תא שזוהו קפסולות של גופים מתאימים על פי קואורדינטות מרכז ואת גודל הרדיוס, הנתונים מיוצאים אל המשתמש בגיליון לניהול.
היתרונות של שיטה זו הם פשוטים אך משמעותי. הראשון, כי חישובים אלה מבוצעים על ידי אלגוריתם מאשר אדם דיוק ואמינות הוגדלה. אין שום ירידה הדיוק או המהימנות בין כמה דוגמאות מנותחות. שנית, גישה זו מבססת על סטנדרטי פוטנציאליים עבור השדה קריפטוקוקוס במקום המצב הנוכחי שבו מדידה קפסולה משתנה על ידי המעבדה. שלישית, מכיוון שטווח המידות קפסולה ידני הם איטי ומונוטוני, אוטומציה מאפשר מדידות מהירה על מספר גדול של תאי שמרים בתורו המקל על תפוקה גבוהה ניתוח נתונים וסטטיסטיקות חזק יותר ויותר.
המגבלות הגדולות של טכניקה זו בא איך הפונקציות אלגוריתם. ראשית, האלגוריתם יפיק רק מעגלים. בעוד קריפטוקוקוס תאים וכמוסות שלהם לקחת על מורפולוגיה מעגלית של, זה יהיה קשה ליישם טכניקה זו לאיתור אובייקט שאינו עגול. שנית, בשל כמה עיגולים מזוהים האלגוריתם CHT יכול לזהות עצום עיגולים המדומה המבוססת על הקצוות החיצוניים של מעגלים באשכולות. עם זאת, גופות תא מטעים המוצגים נתפס בתוך המעגל מדומה בקלות ועוזרת להסיר ערכות הנתונים הנוצרת.
טכניקה זו מיועד למדידת הקפסולות רב-סוכר מעגלית של מינים קריפטוקוקוס בהתבסס על מיקרוסקופיית שדה בהיר דיו הודו; אבל זה יכול להיות מיושם על חדות אחרות מבוסס אובייקט עגול מדידות.
Introduction
קריפטוקוקוס neoformans היא פטרייה פתוגניים נמצאו ubiquitously ברחבי העולם המשויך מחלות אנושיות בעיקר באוכלוסיות immunosuppressed. Neoformans ג שהבולט מהווה גורם משמעותי סך מקרי המוות השנתי ב אפריקה שמדרום לסהרה עקב מחלה זיהומית1. הביטוי הקליני העיקריים של זיהום cryptococcal הוא meningoencephalitis, אשר עוקב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תחבורה נגוע מקרופאגים (הסוס הטרויאני באופן) או מעבר ישיר של מחסום הדם – מוח. Neoformans ג מבטא מספר גורמים התקפה אלימה, כולל היכולת לשכפל את טמפרטורת גוף נורמלית, פעילות אוראז, melanization, ואת היווצרות קפסולה רב-סוכר2. הקפסולה רב-סוכר מורכב חוזרות glucuronoxylomannan glucoronoxylomannangalactan פולימרים והפונקציות כמחסום מגן נגד גורמי עקה ו מארח תגובות חיסוניות2.
למרות הגודל לגודל הקפסולה cryptococcal רב-סוכר לא עקבי שויכה התקפה אלימה, יש ראיות כי זה גורם פתוגנזה2,3,4,5, 6,7. גודל קפסולה מזוהה עם דלקת קרום המוח פתולוגיה6, יכול להשפיע על מקרופאג היכולת לשלוט קריפטוקוקוס זיהום5, יכול לגרום לאובדן של התקפה אלימה אם נעדר8. לפיכך, מדידות גודל קפסולה נפוצים במחקר cryptococcal, אבל יש fieldwide אין תקן שיטת מדידה קפסולה.
כיום, neoformans ג רב-סוכר קפסולה המדידה מבוססת על מדידות ידניות של תמונות מיקרוסקופ, השיטות המדויק של רכישות התמונה והן מידה משתנים על פני מעבדות9,10, 11. הדאגה המיידית לשיטה זו היא כי מספר מחקרים דורשים הרכישה של אלפי מדידות, מה שהופך ולשמירה על רמת דיוק ואמינות קשה. יתר על כן, גם כאשר מתפרסמות התוצאות, יש לעיתים קרובות תיאור לקוי של שיטת מדידה. פרסומים רבים לא מסבירים איך המדידות שלהם התקבלו, איזה מטוס מוקד שימש, איך הם קבעו את הסף עבור זיהוי קפסולה, בין אם הם השתמשו רדיוס או קוטר, בין אם הם השתמשו מדידה אחת או בממוצע מספר, או אחרים פרטים. כמה פרסומים היחידה המדינה שלהם לשיטה כמו איזו תוכנית ששימשה, למשל, “Adobe Photoshop CS3 שימש כדי למדוד את התאים”11. חוסר פירוט תקנון ודיווח באפשרותך להפוך הפארמצבטית קשה אם לא בלתי אפשרי. הבדלים הראייה האנושי, בהירות המחשב, ההגדרות מיקרוסקופ, שקופיות תאורה, גורמים אחרים יכולים להשתנות לא רק בין יחידים אלא בין דגימות, ואילו חישובים בהתבסס על יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה יישאר קבוע, החלים בין הדגימות. טכניקה זו נוצר בהקשר של מתן טכניקה סטנדרטית, מדויק, מהיר ופשוט למדוד גדלים קפסולות של שדה שבו היה קודם.
כאמור, האלגוריתם CHT ותיקה, קבצי script כדי לזהות באופן אוטומטי את העיגולים נכתבו לפני. שיטה זו משפרת בשני תחומים איפה סקריפטים אחרים יפול קצר. ראשית, גילוי פשוט עיגולים אינה מספיקה, כי עם תאים cryptococcal שני מעגלים נפרדים חייב להתגלות אחד ביחס לשני. שיטה זו במיוחד מזהה תא גופות בתוך קפסולות מפלה בין השניים, מבצעת את החישובים רק על זוגות הגוף-קפסולת הרלוונטיים. שנית, אפילו כאשר בעקבות באותו פרוטוקול, חוקרים שונים יגיעו עם שונה רכשה תמונות. בכך שהוא מאפשר את השליטה חוקר כל פרמטר אלגוריתם, כלי זה יכול להיות מותאם כדי להתאים למגוון רחב של שיטות רכישה. יש צורך היקף מתוקננת, המטרה, סינון וכן הלאה.
טכניקה זו ניתן בקלות ליישם בכל מצב שבו החוקר צריך לזהות החוגים בתוך תמונה בניגוד עם הרקע שלהם. שניהם עיגולים בהיר יותר וכהה יותר הרקע שלהם יכול להתגלות, ספרתי, נמדד בעזרת טכניקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים של טכניקה זו מכין את השקופית אינדיה אינק, רכישת תמונות מיקרוסקופ. בעוד האלגוריתם נבדק בהצלחה עם מגוון רחב של טכניקות שקופיות ותמונה הפרוטוקול המומלץ מתואר בכתב היד. הקפסולה רב-סוכר מזוהה בהתבסס על הכללת חלקיקי דיו הודו מהתחום של הקפסולה, כמו חלקיקי האלה גדולות מדי לחדור לר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להכיר בואן אנתוני שקופיות אשר שימשו השוואה side-by-side האדם השני, כמו גם סברינה נולאן שקופיות אשר שימשו כמו השלישי אנושי-לצד השני השוואה מיקרוסקופ.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
