血管紧张素 II. 型小鼠白细胞滚动和粘附的可视化技术及缺陷
Summary
这份手稿描述了使用转基因的记者小鼠和不同的管理途径荧光染料在血管紧张素 II 诱导高血压使用活体视频显微镜的血管评价免疫细胞的活化作用及其能够滚动和坚持内皮。
Abstract
荧光活体视频显微镜 (综合防治) 的血管是一个既定的方法来评估免疫细胞的活化作用和他们的能力, 并坚持内皮层。通常使用荧光染料或荧光偶联抗体的注入来可视化循环细胞。另外, 还可以使用荧光报告小鼠。白细胞的相互作用, 特别是溶菌酶 M+ (LysM+) 单核分子, 血管壁在促进血管功能障碍和动脉高血压方面起着举足轻重的作用。我们在这里提出的技术, 以可视化和量化白细胞轧制和粘附在血管紧张素 II (ii) 诱导高血压的小鼠通过综合防治。
导管的植入会损害血管壁, 导致改变的血细胞反应。我们比较了不同的注射技术和管理路线, 以形象化的白细胞在一个 LysMCre 的+表意文字+小鼠广泛表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的条件表达在 LysM+单元格。为了研究 LysM 的+细胞活化, 我们使用了 ii 灌注小鼠, 其中白细胞的滚动和粘附增加到内皮。我们要么通过静脉导管注射吖啶橙, 要么直接通过尾静脉, 比较滚动和黏附细胞的数量。我们发现, 颈静脉导管植入本身增加了在假灌输的 LysMCre+表意文字+小鼠与对照组相比滚动和黏附 LysM+细胞的数量。这种活化作用增强了 ii 的小鼠。有趣的是, 直接通过尾静脉注射吖啶橙并没有增加 LysM 的+细胞粘附或在假灌注小鼠中的滚动。因此, 我们证明了转基因小鼠表达荧光蛋白在实验过程中不干扰体内过程的重要性。此外, 尾部静脉注射荧光示踪剂可能是一个可能的替代静脉导管注射。
Introduction
动脉高血压增加了心血管疾病和死亡的风险, 促进动脉粥样硬化, 冠心病, 动脉或静脉 thromboembolisms 的发展1。高血压的发展取决于环境、遗传、内分泌和血流动力学因素的相互作用。目前, 免疫及相关炎症在高血压病因中起重要作用2。
在免疫细胞, T 淋巴细胞以及单核和巨噬细胞被发现是因果关系的 ii 诱导的血管炎症和高血压, 部分与他们的能力触发活性氧的物种3。巨噬细胞集落刺激因子缺乏小鼠表现出减少对 ii 的反应血压升高和血管炎症4。在以前的工作中, 我们可以证明 LysM + 单核细胞驱动血管功能障碍和炎症的 ii 诱发高血压5。最近, 我们描述了一个新的途径, 凝血因子 XI 配合血小板和血管壁诱导凝血酶依赖性血管炎症6。目前有关免疫系统在高血压中的作用的知识最近总结和回顾了罗德里格斯-Iturbe et al。7
由于免疫细胞参与高血压的发展变得明显, 研究血管与免疫细胞相互作用的模型和技术成为必要。荧光的血管综合病是一个有用的工具, 观察体内循环血细胞和内皮之间的相互作用,8,9,10。用这种技术, 注射染料插与脱氧核糖核酸 (例如吖啶橙色) 能形象化有核的细胞 (循环和从内皮)。在动脉或静脉损伤模型中, 可以注入 rhodamin-6G 或ˊ (现金流量) 的分离血小板, 以显示血小板丰富的血栓.
通常, 颈静脉导管用于注射示踪剂或标记血小板。改变内皮和随后活化的凝血叶栅都知道有影响单核细胞活化。内皮损伤立即导致血小板活化通过内基质分子密封的组织, 随之而来的单核细胞吸引和激活11。相反, 一个完整的内皮细胞是已知的抗凝血特性 (例如,通过组织因子途径抑制剂或血栓调节蛋白)12和直接抑制作用的单核,例如, 通过分泌胞外囊泡含有 rna13。单核细胞是已知的产生组织因子, 外源性的凝血级联和表达蛋白酶活化受体 (部), 可以激活凝血酶和参与单核激活14,15.因此, 任何血小板活化或由于血管损伤引起的凝血级联, 可能对单核细胞活化产生意想不到的影响, 并干扰观察到的现象。在表意文字转基因 LysM 转基因小鼠的帮助下, 一个 double-fluorescent 的报告鼠 (LysMCre+表意文字+), 我们建议详细研究注射用导管的效果和替代方法在 LysM+粒细胞在小鼠动脉高血压模型中的作用16。
Protocol
Representative Results
Discussion
LysM+单核细胞曾被证明与高血压的发展有牵连5。在这里, 我们表明, LysM 的免疫细胞的+ , 并坚持到内皮层, 以响应 ii 输液。此发现是使用 LysMCre+表意文字+小鼠获得的, 从我们以前的研究中探索免疫细胞在高血压中的作用在体内通过对吖啶橙注射液的可视化白细胞,6,10。因此, 细胞类型的黏附在内皮的歧视是不可能的。
这是一个非常有用的工具的血管研究和体内观察细胞直接在血管, 但注射染料的影响, 在一个外科插入导管的帮助下, 高血压炎症的背景仍然未知。为了评价导管和吖啶橙注射液的潜在作用, 我们利用了 LysMCre+表意文字+鼠标。ii 输液增加了滚动的 LysM+细胞的数量到内皮。插入导管进入颈静脉放大的效果和更多的滚动和粘附白细胞检测 ii 注射小鼠导管与无导管植入的小鼠相比。这表明, 植入颈动脉导管导致全身炎症反应的伤口愈合的情况下覆盖与免疫反应看到的高血压18。此外, 由于颈静脉靠近颈部动脉, 另外的免疫活化可能是通过影响颈静脉而发生的。由于这种作用是不存在的, 当注射直接进入尾部静脉, 我们可以假设, 该效应不是由于染料, 而是插入导管的程序。我们在这里展示了转基因的报告鼠的重要性, 表达荧光蛋白, 以不干涉在体内过程中的实验。此外, 尾部静脉注射荧光示踪剂可能是一个可能的替代静脉导管注射。
该过程的一个关键步骤是 ii 输液。尾袖评估的血压可以作出, 以控制的有效性, ii 交付的泵。2−3天后血压应增加。为了限制可能影响 LysM+细胞活化的炎症, 在植入泵的切口处, 应该用缝合线而不是夹子来做。必须注意的一个限制是尾静脉注射: 为了使最好的数据获取, 4 视频通常是为每一个颈动脉。如果荧光信号下降, 50 µL 吖啶橙注射, 但与尾部注射更难进行多次注射和保持动脉稳定在显微镜下的目标。颈静脉导管存在的持续时间也可能调节免疫细胞的活化作用, 因为它影响了在导管植入后4小时内制备的富含血小板血浆的凝血活化19。这方面的导管植入需要进一步的调查。
最后, 即使我们赞赏颈静脉导管植入对 LysM 的影响, ii 输液后, 我们不能完全估计的准备, 皮肤移除和颈动脉隔离在潜在的 LysM +细胞的作用激活.我们的结论是, 使用荧光报告鼠像 LysMCre 的+表意文字+鼠标建议, 以避免破坏船只的完整性在动物准备为在体内成像。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了德国教育和研究部 (BMBF 01EO1003 和 BMBF 01EO1503) 的支持。
Materials
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
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