JoVE Journal > Immunology and Infection
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免疫与感染

Eine Kokulturen Methode zu untersuchen, das Übersprechen zwischen den x-ray bestrahlten Caco-2 Zellen und PBMC

Published: January 30, 2018
doi:
10.3791/56908
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1Dipartimento di Fisica,Università degli Studi di Pavia, 2IRCCS Istituti Clinici Scientifici Maugeri

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um das Übersprechen zwischen Caco-2 X-ray-bestrahlt und peripheren mononukleären Zellen (PBMC) zu untersuchen. Das Protokoll beginnt mit Caco-2 Bestrahlung und Set-up der Co-Kultur mit PBMC; Trans-epithelialen elektrischer Widerstand wird anschließend regelmäßig über 48 h und western Blot durchgeführt in Caco-2 und PBMC gemessen.

Abstract

Das Protokoll angenommen diese Arbeit soll zu entwirren, wie Röntgenstrahlen Radardetektoren funktionieren der Darmbarriere, mit Schwerpunkt auf dem Zusammenspiel von kolorektalen Tumorzellen und das Immunsystem. Kolorektalen Karzinom ist die häufigste Form von Krebs, in der Regel durch Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie behandelt. Vorteile der Strahlentherapie bei der Ausrichtung des Tumors sind bekannt. Allerdings sind auch nur Aufnahmen von gesundem Gewebe von großer Bedeutung, insbesondere im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Darmbarriere und das Immunsystem. Die angenommene Einrichtung ermöglicht es, um das Zusammenspiel zwischen zwei Zellpopulationen in einem Zustand mehr ähnlich dem physiologischen, im Vergleich zu normalen Zellkulturen zu studieren. Zu diesem Zweck greifen wir auf verschiedene Techniken und eine in-vitro- Kokultur Modell verwendet, basierend auf Caco-2 Zellen differenziert als Monolage und PBMC, teilen das gleiche Nährmedium. Dieses Protokoll wurde setzt auf sowohl makroskopischen Effekte, d. h. Zellviabilität und Trans-epithelialen elektrischen Widerstand (TEER) und durch western-Blot, molekulare Veränderungen, d.h. die Aktivierung des entzündlichen-Signalwegs in entwickelt Immunzellen und die engen Kreuzung Proteinexpression in Caco-2 Zellen. Erstbewertung der Strahlenwirkung im Zellviabilität Caco-2 wurde über die 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT) und Trypan blau Assays, bewertet, während TEER in festen Zeitabständen mit einem Ohmmeter gemessen wurde speziell für Kokultur Systeme. Auf diese Weise können die Auswirkungen durch Strahlung, die Anwesenheit des peripheren Blutes mononukleären Zellen (PBMC) und schließlich ihre synergistische Wirkung nachgewiesen werden. Durch diese ergänzende Techniken beobachteten wir eine hohe Radio-Resistenz von Caco-2 im Bereich von 2 bis 10 Gy von Röntgenstrahlen und eine erhöhte Durchlässigkeit der Caco-2 Monolage wenn PBMCs wurden hinzugefügt. Insbesondere wurde PBMC Präsenz gefunden, die Variation in der engen Kreuzung Gerüst Proteine Ausdruck zugeordnet werden soll.

Introduction

Die Methodik, die in dieser Arbeit wurde entwickelt, um das Zusammenspiel von colorectal Krebszellen und das Immunsystem, Nutzung einer Einrichtung näher auf den physiologischen Zustand im Vergleich zu normalen 2-dimensionale Zellkulturen untersuchen.

Kolorektalen Karzinoms (CRC) gilt als die dritthäufigste Form von Krebs, mit mehr als 1 Million Fälle weltweit (Global Cancer Observatory, internationale Agentur für Forschung auf Krebs, World Health Organization, http://gco.iarc.fr). Management von CRC wird routinemäßig durch Operation, Chemotherapie oder Strahlentherapie1durchgeführt. Im Vergleich zu invasiven Techniken wie Operation oder Chemotherapie vermeidet Strahlentherapie weitgehend die typischen nachteiligen systemischen Reaktionen aus dieser klinische Ansätze durch die lokalisierte Lieferung von Strahlendosis. In das umliegende gesunde Gewebe, Entzündungen mit direkten Schädigung gesunder Zellen und Schäden durch ungezielte Effekte2,3,4vermittelt auslösen können Nebenwirkungen auftreten. Fokussierung auf die negativen Auswirkungen durch die Bestrahlung während der Behandlung von Darmkrebs, müssen zwei Aspekte untersucht werden. Erstens könnte die Mechanismen der intestinalen Dichtigkeit durch Strahlung Lieferung verursacht wiederum die Möglichkeit von Nebenwirkungen aufgrund einer veränderten Eindämmung der Bakterienpopulation und die parazellulär Passage von Molekülen und gelösten Stoffen verändert werden. Zweitens wirkt die Anwesenheit von Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) als Vorposten des Immunsystems, mit der Funktion der Steuerung Bakterienwachstum und Vermittlung der allgemeinen Immunantwort5,6,7. Um diese Funktionen zu erfüllen, bleibt Darm Dichtigkeit durch die Funktion der Knoten komplexe zwischen den Membranen der Zellen. Aus diesen Gründen wurden die induzierte nachteiligen Folgen durch verschiedene Dosen von Röntgenstrahlen in Caco-2 Zellen allein und in Ko-Kulturen mit PBMC untersucht.

Obwohl Studien an Zellkulturen der ersten Setline Untersuchung in der biomedizinischen Forschung ist, könnte das Fehlen von detailliertes Wissen über die Mechanismen, die Zelle Biologie und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen fahren wann kritisch Annäherung an die Studie der Physiologie der Organe, Systeme und Geräte, die leicht im Labor wiederhergestellt werden können. Daher haben wir beschlossen ein Kokulturen Setup anzunehmen erlaubt die Untersuchung von zwei Zellpopulationen zusammen und die Zerlegung der Aspekte der interzellulären und extrazelluläre Mechanismen.

Kokultur ist eine Technik, die ausgenutzt, wenn epitheliale Funktionen und das Zusammenspiel zwischen verschiedenen Zelltypen zu studieren. Insbesondere wird die Verwendung dieser Technik in unserem Fall obligatorisch, weil Epithelien aus Zellen, die durch Polarität gekennzeichnet bestehen. Im Falle der Darmbarriere Enterozyten zeigen eine wohldefinierte Polarisation mit apikalen und basolateralen Pole normalerweise getrennt durch die Anwesenheit von engen Kreuzung erstellen Adhäsionsmoleküle. Diese Abschottung ist für die Gewebe-Physiologie, Vermeidung von parazellulär Menschenhandel und die Verbringung von bestimmten Molekülen nur erforderlich. Diese Funktion ist natürlich unmöglich, mit einer normalen Zelle Kultivierung Setup neu. Darüber hinaus reproduziert die Annahme der Kokultur Einrichtung das Vorhandensein von Immunzellen nur in der basolateralen Oberfläche, während die apikale Oberfläche (entsprechend Darmlumen) nicht direkt in Kontakt mit anderen Zellen.

Vor kurzem, Caco-2-Zell-Linien mehr Bedeutung als in-vitro- Modell der Darmbarriere gewonnen. Obwohl von menschlichen Darm Adenokarzinom abgeleitet, Caco-2 Zellen pflegen die Fähigkeit der Differenzierung und erstellen Sie eine funktionale polarisierte Monolage8ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften der Zellmembran wenn in einem Kokultur Einsatz gewachsen.

Caco-2 Kultivierung auf eine poröse Membran ist ein etablierter in-vitro- Modell der intestinalen monomolekularen Film, seit eine Verbesserung der Kokultur zwischen Caco-2 und anderen Zellen. Diese Einrichtung hat häufig zu messen das Übersprechen zwischen den verschiedenen Zelle Arten9 und kann verwendet werden, um Caco-2 entwirren beunruhigt Reaktion auf exogene Reize wenn in Kokultur, in Bezug auf Caco-2 allein kultiviert.

Viele Studien haben angesprochen Caco-2 Verhalten bei der Zusammenarbeit mit sowohl nicht-pathogenen Bakterien kultiviert und peripheren Blut Mononukleäre Zellen, insbesondere das Übersprechen mit dem Immunsystem10aufzuklären. Pozo-Rubio Et al. 11 studierte die Expression von mehreren Zytokine in einem Caco-2/PBMC Kokultur mit Bifidobakterien Caco-2 Zellen stimuliert. Ihre Arbeit hervorgehoben, wesentliche Änderung, Zytokin-Expressionsprofile abhängig von bakteriellen Stimulation in Anwesenheit/Abwesenheit von PBMC durchgeführt. Ihre Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass das Vorhandensein von PBMC Caco-2, Bifidobakterien sensibilisiert.

Unterschiedliche Reaktionen von Caco-2 Zellen, nicht-pathogene und pathogene Bakterien sind von verschiedenen Forschungsgruppen untersucht worden. Parlesak Et Al. 12 zeigt die immunsuppressive Wirkung von Caco-2 Zellen auf Escherichia coli-PBMC angeregt. Darüber hinaus Haller Et Al. 13 studierte die Antwort von Caco-2 Zellen stimuliert mit beiden Lipopolysaccharid (LPS) von enteropathogenic E. Coli spp. oder nicht enteropathogenic Bakterien i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., Stärkung der Vermutung, dass die Caco-2 Zellen Reaktion streng auf das Vorhandensein von Leukozyten in Kokultur Aufbau abhängt.

Durch verschiedene ergänzende Labor Tests durchführen (z.B. western-Blot, Trans-epithelialen elektrischen Widerstand, MTT, etc.), neben der Analyse der verschiedenen Zelltypen in Kokultur angebaut, die ganze Methode verspricht Ergebnisse, die mehr Vertreter dessen, was wirklich in Vivo passiertangesehen werden können. Dieser Aufbau ermöglicht darüber hinaus die Trennung der verschiedenen Kokultur Fächer, ermöglicht nicht nur die Studie der Zelltypen beteiligt, sondern auch die interzelluläre Signalmoleküle im oberen und unteren Fach oder in Gegenwart veröffentlicht vs. fehlender Kokultur.

Protocol

Das folgende Protokoll beinhaltet Menschenblut Rückzug von gesunden Probanden. Blutspender schriftliche Einwilligungserklärung vor der Einschreibung. Dieses Verfahren ist in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und Blut Auszahlungen wurden durch einen professionellen medizinischen Assistenten durchgeführt. (1) Zell-Kultur und Kokultur Set-up Bereiten Sie eine Woche vor der Bestrahlung, eine Caco-2 Zellsuspension mit 2,5 × 105 Zellen/mL in frischen RPMI1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt. Samen 2 mL Zellsuspension in sterilen 1 µm-Poren Durchmesser Zellkultur Einsätze für 6-Well-Platten und das Einfügen in eine 6-Well-Platte genommen.Hinweis: Die Zelle Kultur Einsätze müssen durch Inkubation mit sterilen komplette Medium vor der Aussaat Zelle aktiviert werden. Nährmedien sollten in diesem Fall verworfen und durch Zelle Aussetzung Medien ersetzt werden. Fügen Sie 3 mL frisches RPMI1640 Medium mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin in jeder Bodenfach ergänzt und Kulturzellen bei 37 ° C in einem Inkubator mit feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2. Am selben Tag der Caco-2 Zelle Bestrahlung, sammeln menschliche Vollblut in handelsüblichen Lithium-Heparin beschichtet 6 mL Röhrchen (Schlauch Größe: 13 x 100 mm). Anschließend isolieren Sie peripheren mononukleären Zellen (PBMC) mit Ficoll Farbverlauf. PBMC zu trennen, setzen Sie 25 mL Ficoll in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL und Schicht ein gleiches Volumen von Vollblut verdünnt 1:1 mit RPMI1640 auf die Ficoll-Oberfläche.Hinweis: Ein normale gesunde Spender hat in der Regel ca. 4-10 × 106 PBMC/mL. Zentrifugieren Sie die 50 mL-Röhrchen bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur. Sanft die PBMC an der Schnittstelle zwischen Ficoll und Plasma durch Absaugen mit einer Pasteurpipette sammeln und steckte sie in eine 15 mL konische Rohr. Waschen Sie die PBMC zweimal durch Hinzufügen von 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und PBMC 250 X g für 10 min zentrifugieren. Kultur PBMC für maximal 3-5 h in T25 cm2 Flaschen in RPMI1640 Medien, wie beschrieben vor, bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2abzuschließen.Hinweis: Sammeln von PBMC am Tag des Experiments und Samen 2 × 106 Zellen/Well, in 3 mL des kompletten RPMI1640 Medium in das Bodenfach des Co Kultur ausgesetzt. Einsätze mit Caco-2 Zellen werden in PBMC-haltigen Brunnen 30 min nach der Bestrahlung übertragen. PBMC gesammelt aus dem Vollblut kann nicht in Kultur mehr als ca. 72 h gehalten, wenn nicht mit z.B.angeregt. Phytohaemagglutinin (PHA), nachdem die Lebensfähigkeit der Zellen verloren geht.Achtung: Die Qualität und Sicherheit von Blut und Blutprodukten müssen während des gesamten Prozesses gewährleistet werden. 2. Bestrahlung Set-up Hinweis: Bestrahlung von Caco-2 Zellen wurde mit einem Linearbeschleuniger routinemäßig zur Behandlung verschiedener Krebsarten in der Strahlentherapie-Abteilung des Istituto di Ricovero e Cura ein Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italien) durchgeführt. Legen Sie Röntgenstrahlen Photonenenergie auf 6 MV Spitze. Der Linearbeschleuniger arbeitet in einem pulsierenden Regime (Zeit zwischen zwei aufeinander folgenden Impulsen etwa von 4 ms; Dauer eines einzelnen Impulses über 5 µs mit einer Dosis bewerten bis 1 × 10-3 Gy/p). Legen Sie die 6-Well-Platten mit Wendeplatten mit Caco-2 auf die Flugbahn der Röntgenstrahlen auf einem 1,4 cm dicken Plexiglas Blatt (entspricht einem Abstand etwas größer als der Aufbau der verwendeten Strahlung) bei 100 cm von der Quelle der Strahlung. Legen Sie eine 0,5 cm dicke Bolus auf jede Probe, bevor die Bestrahlung tritt um den rückgestreuten Strahlungsanteil und die geladenen Teilchen Gleichgewicht zu gewährleisten. Die Zellen zu bestrahlen (Dosen im Bereich von 2 bis 10 Gy) mit einem flachen und symmetrisch (± 2 %) 20 x 20 cm2 Strahlungsfeld und eine Dosisleistung von 3 Gy/min.Hinweis: Kontrollieren “Schein”-bestrahlte Zellen unterzog die gleichen verfahrensrechtlichen Voraussetzungen der bestrahlten, ohne betreten des Zimmers Bestrahlung (empfangene Dosis: 0 Gy).Achtung: ionisierende Strahlung erzeugenden Geräte dürfen nur von Fachpersonal verwendet werden. 3. Zelle Lebensfähigkeit Assay (MTT-Assay) Hinweis: Caco-2 Zelle metabolische Aktivität wurde durch die 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT) Assay14bewertet. 2 × 10 Samen5 Caco-2 in einer 24-Well-Platte 24 h vor der Bestrahlung in 1,25 mL von kompletten Medium. Bestrahlen Sie die Zellen wie in 2.1-2.4 beschrieben dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2. 21 h nach der Bestrahlung, fügen 100 µL MTT-Lösung 5 mg/mL und halten die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 für 3 h. Den Überstand verwerfen und die Zellen mit 1 mL PBS waschen. Formazan-Kristalle durch Zugabe von 500 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in jedes gut auflösen und bewerten die Extinktion mit einem Multi-well-Platte-Reader bei λ = 570 nm. Wiederholen Sie Schritt 3.3-3.4 – 3.5-3,6 bei 45 h nach der Bestrahlung.Hinweis: Ergebnisse sind als eine Störung aus dem entsprechenden Schein Zustand dargestellt, die zu 100 % normalisiert ist.Achtung: DMSO ist brennbar und irritierend für Haut, Augen und Atemwege (GHS07, GHS08). Bei Berührung mit den Augen sofort mit reichlich Wasser ausspülen und Arzt konsultieren. MTT ist eine reizend für Haut, Augen und Atemwege (GHS07, GHS08). Bei Berührung mit den Augen sofort mit viel Wasser spülen und Arzt konsultieren. (4) Anteil der lebensfähigen Zellen Bestimmung (Trypan blau färben Ausgrenzung Assay) Hinweis: Prozentsatz der lebensfähigen Zellen wurde von Trypan blau färben Ausgrenzung Assay bewertet. 2 × 10 Samen5 Caco-2 in 24-Well-Platte 24 h vor der Bestrahlung in 1,25 mL von kompletten Medium. Bestrahlen die Zellen mit Dosen im Bereich von 0 – 10 Gy (siehe Schritte 2.1-2.4) dann die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24-48 h inkubieren. Nachdem die beiden gewählten Zeit Punkte, Waschen der Zellen mit PBS, verwerfen Sie, dann fügen Sie 100 µL Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-Lösung. Setzen Sie die Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 für 2 min dann komplette Medium um die enzymatische Reaktion zu verhaften. Sammeln Sie die Zellen in einem 1,5 mL-Röhrchen und Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 500 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und auszusetzen Sie Zellen in 50 µL PBS wieder. Die Zellsuspension mit 50 µL Trypan blau Farbstofflösung mischen und die Mischung für 3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zählen die gefärbten (nicht-lebensfähige) und ungefärbt (lebensfähige) Zellen mit einer Bürker Kammer. (5) Trans-epithelialen elektrischen Widerstand (TEER) 5 × 105 Caco-2 Samenzellen Co Kultur eine Woche vor der Bestrahlung in 6-Well-Platte Einsätze (Polyethylenterephthalat (PET), 2 x 106 Poren/cm2). 1 h vor der Bestrahlung, messen den TEER mit einem Voltmeter/Ohmmeter. Bestrahlen Sie Zellen, wie in 2.1-2.4 beschrieben. Inkubieren Sie Caco-2 Zellen in Anwesenheit/Abwesenheit der Kokultur mit PBMC bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2. Maß für die ersten paar Stunden nach Bestrahlung, TEER stündlich und danach alle 3 Std. bis zu 48 Stunden. 6. Western-Blot Analyse der Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB und XIAP 5 × 105 Samenzellen 1 Woche vor Röntgenstrahlen Exposition in 6-Well-Platte Kokultur fügt (PET, 2 x 106 Poren/cm2) und bestrahlen Zellen wie in 2.1-2.4 beschrieben. Inkubieren Sie Caco-2 Zellen in Anwesenheit/Abwesenheit der Kokultur mit PBMC bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2. 48 h nach der Bestrahlung, bereiten Caco-2 und PBMC Zelle Lysates durch die Behandlung der Zellen mit Zelle Lysis Puffer und speichern Proben bei-20 ° C.Hinweis: das Protokoll kann hier angehalten werden. Gesamt-Protein-Menge von Bicinchoninic Säure (BCA) Methode zu quantifizieren.Hinweis: das Protokoll kann hier angehalten werden. Mischen Sie gleiche Mengen von total Proteine mit Laemli Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol hinzugefügt (Endkonzentration von β-Mercaptoethanol ist 5 %), die Proben bei 95 ° C für 5 min erwärmen und mit 10.000 x g drehen. Last Proben in einem 4-20 % Gel Fertigteile und führen die Elektrophorese bei 120 V für 1 h Transfer Proteine auf einer Polyvinildiene Fluorid (PVDF) Membran. Unspezifischen Bindungsstellen blockieren, indem Inkubation PVDF-Membran bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreie Trockenmilch (NFDM) mit PBS-Puffer hinzugefügt mit 0,2 % Tween-20 (PBT). Waschen Sie die Membran dreimal mit 10 mL 0,2 % PBT 5 min. lang. Inkubieren Sie die Membran mit sanften Agitation für 1 h bei Raumtemperatur vor gestellt über Nacht bei 4 ° C mit der folgenden primären Antikörper: Anti-Claudin-1 Anti-ZO-1, Anti-ZO-2, Anti-Afadin, Anti-occludin, Anti-NF-κB, Anti-XIAP und Anti-Aktin. Waschen Sie die Membran dreimal mit 10 mL 0,2 % PBT 5 min. lang. Inkubieren Sie die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase-HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur unter schonenden rühren. Waschen Sie die Membran dreimal mit 10 mL 0,2 % PBT 5 min. lang. Bei Raumtemperatur entwickeln Sie fotografische Filme durch Inkubation der Membranen mit verstärkten Chemo-Lumineszenz Kit. Erwerben Sie Filme mit einem Scan-System und quantifizieren Sie die erhaltenen Bands mit geeigneten Bildanalyse-Software.Hinweis: Die Auswertung der Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 und ZO-2 erfolgt in Caco-2 Zellen. Die Auswertung von NF-kB und XIAP erfolgt in PBMC.Achtung: β-Mercaptoethanol ist giftig (GHS05, GHS08, GHS06 GHS09). Nicht atmen Sie der Dämpfe ein, vermeiden Sie Freisetzung in die Umwelt und tragen Sie individuellen Schutzvorrichtungen und Atemschutz zu. Bei Verschlucken sofort Fragen Sie, für eine medizinische Beratung. 7. statistische Analyse Um festzustellen, ob die Strahlenbelastung und der Kokultur eine statistisch signifikante Störung auslösen, führen Sie einen zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) Test mit multiple Vergleiche für wiederholte Messungen (mit Bonferroni Post-hoc-Tests zu vergleichen replizieren bedeutet). Wenn nicht anders angegeben, berechnet die statistische Signifikanz (p) von zweiseitigen Student t-Test. Jeder Wert ist der Mittelwert von ≥3 unabhängigen Experimenten ± Standardfehler des bedeuten (SEM).

Representative Results

Eine Woche vor dem Experiment, sind Zellen auf die poröse Membran des Einsatzes gesät und erlaubt, in den folgenden Tagen wachsen. Die Höhe des Zusammenflusses kann entweder mit einem inversen Mikroskop überprüft werden oder über die Messung der TEER-Werte. In der Tat hält während der Wachstumsphase TEER erhöhen, bis die poröse Membran von Zellen abgedeckt wurde und sie eine differenzierte Zelle monomolekularen Film bilden. Wenn Zellen vermehren sich schneller/langsamer, könnte das Experiment zu früheren/späteren Zeitpunkten zu beginnen nach ausgesät. Beim Zusammenfluss, Zellen werden dann gebracht auf die Bestrahlung Anlage, Minimierung der vermittelten Umweltbelastungen (Temperatur oder pH-Wert), vor dem Start der Kokultur mit/ohne PBMC, ausgesät in das Bodenfach (Abb. 1A), oder Bewertung der Proliferation von Caco-2 Zellen. Angesichts der anfänglichen Aussaatdichte sollte am Tag 0 Zellen erreichen 100 % Zusammenfluss und erstellen Sie eine differenzierte Monolage von epithelialen Zellen, die durch das Plateau im TEER, siehe Abbildung 1Bbeobachtet werden können. Sobald die Zellen diesen Status erreicht haben, wird der TEER-Wert relativ konstant über der folgenden Woche gehalten, solange die alten Kulturmedium mit frischem Medium, mindestens einmal pro Woche (Abbildung 1B) ersetzt wird. Wie in Abbildung 1C, zeigen MTT-Assay keine statistisch signifikante Abweichung von der proliferativen Status der Caco-2 Zellen weder bei 24 h auf 48 h, unabhängig von der Dosis erhalten (bis zu 10 Gy). Ein anderes Ergebnis wurde über die kurzfristigen Sterblichkeit von Caco-2 Zellen beobachtet. Zu beiden Zeitpunkten Trypan blau Färbung zeigen eine Erhöhung der Dosis-abhängige Zelle Sterblichkeit. Diese Ergebnisse zeigen einen deutlichen Einfluss der Strahlenbelastung, obwohl die Prozentsätze von abgestorbenen Zellen sehr gering, scheinen vor allem wenn man bedenkt, dass die gelieferten Höchstdosis (10 Gy) nur etwa 20 % des Zelltods (Abbildung 1D) produziert. Proben wurden Co kultiviert, mit oder ohne PBMC im unteren Fach. Angesichts der Tatsache, dass PBMC keine äußeren Reiz zu vermehren, galt eine 48 h Experiment ideal, um die Vorspannung von PBMC beginnen zu sterben eingeführt zu vermeiden. Daher wurde von unmittelbar vor der Bestrahlung TEER regelmäßig für 48 h gemessen, um vorübergehende Nebenwirkungen verursacht durch die Bestrahlung Protokoll den Überblick behalten. Wie in Abbildung 1 – E-Fgezeigt, TEER-Werte werden als relative Variationen in Bezug auf die vorbehandelte Zustand (die Größenordnung von 1200-1500 Ω·cm2waren) besser markieren Sie die Störung, die durch die Röntgenbestrahlung induziert präsentiert und und/oder durch die Anwesenheit/Abwesenheit von PBMC in der Kokultur. In beiden Fällen eine anfängliche vorübergehende Spitze klar zum ersten Zeitpunkt nach der Strahlenexposition ersichtlich die Bestrahlung Verfahren zugeschrieben werden können. Wenn nicht in Kokultur mit PBMC (Abbildung 1E), TEER Werte nahezu konstant bis zu 48 h, nach 10 Gy Röntgenstrahlung, Zellen zeigen einen anhaltenden Rückgang der TEER ab 3 h nach Bestrahlung. Das Vorhandensein von PBMCs ändert vollständig die TEER zeitliche Dynamik (Abbildung 1F). Für alle Dosen ist eine Reduzierung der TEER deutlich zu beobachten von 3 h bis zu ca. 30 h nach Bestrahlung, wenn TEER erscheint auf einen konstanten Wert (Abbildung 1F) zu begleichen. Tight Junction-komplexe Ausdruck Ebenen wurden in Caco-2 Zellen Lysates durch western-Blot-Test untersucht. Caco-2 Zellen waren ionisierender Strahlung (mit Dosen von 0, 2 und 10 Gy) ausgesetzt und anschließend gewachsen, allein oder in Kokultur mit PBMCs im Bodenfach für 48 h (siehe Abbildung 2A-F). Claudin-1 und Occludin (Abbildung 2A, 2 b) fanden sich nicht erheblich von Röntgen-und/oder Kokultur mit PBMC geändert werden. Große Schwankungen wurden stattdessen in einem Gerüst Protein ZO-1, ZO-2 und Afadin (Abbildung 2C, 2D, 2E) beobachtet. Insbesondere wird eine Reduktion ZO-2 Ausdruck schon nach 2 Gy wenn in Kokultur mit PBMC nur bei 10 Gy beobachtet, wenn Caco-2 wuchsen allein. Afadin Ausdruck Niveaus sind stattdessen erst nach 10 Gy Röntgenstrahlung, eine zusätzliche Ermäßigung bei Caco-2 Co kultiviert mit PBMCs betroffen. PBMCs Co kultiviert mit Caco-2 wurden in Bezug auf die entzündlichen Zustand analysiert, insbesondere der nuklearen Transkriptionsfaktors kB (NF-kB) und der X-chromosomal Inhibitor der Apoptose Proteingehalte (XIAP) wurden untersucht (Abbildung 2 G-ich). NF-κB Gesamtbetrag wirkte nicht der Kokultur mit Caco-2 verschiedenen Strahlendosen (Abbildung 2G) ausgesetzt. Im Gegenteil, waren die XIAP in 2 Gy und 10 Gy-Ko-Kulturen, 4-fach reguliert zwar die große Variationen eine höhere Anzahl von Proben, die analysiert werden verlangen, um solche Schwankungen zu reduzieren und eine bessere statistische Aussagekraft gewinnen. Wie in Abbildung 2F und 2I, scheinen einige unspezifische Bänder neben dem erwarteten Molekulargewicht des Proteins des Interesses. Es sei denn, wahr und unspezifische Bänder leicht unterscheidbar sind, sollten verschiedene Antikörper und/oder BSA oder NFDM Konzentrationen berücksichtigt werden. Abbildung 1 . Insgesamt Versuchsaufbau und makroskopischen Effekte der Strahlenbelastung und/oder PBMC Kokultur. (A) schematische Darstellung des Modells Kokultur. (B) TEER Messwerte täglich aus den Startwert der Caco-2 Zellen zur Beurteilung des ordnungsgemäßen Wachstum und Differenzierung Zustands von der Monolage. Zellviabilität C) und D) Sterblichkeit in Caco-2 (0, 2, 5 und 10 Gy) Röntgenstrahlen ausgesetzt. E) TEER Messungen in Caco-2 Zellen bestrahlt mit 0, 2 und 10 Gy von Röntgenstrahlen ohne kultiviert oder F) mit PBMCs. Jeder Wert ist der Mittelwert von ≥3 unabhängigen Experimenten ± SEM. * p-Val < 0,05; ** p-va l < 0,01; p-Val < 0,001. Graphen von Morini Et al.angepasst. 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2. Western-Blot Ergebnisse der Caco-2 und PBMC Lysaten. Ausdruck der engen Kreuzung Proteine (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) und Afadin (E)) in Caco-2 nach 0, 2 und 10 Gy von Röntgenstrahlen und in Anwesenheit/Abwesenheit von PBMC in Kokultur Schutzniveau. Werte sind auf Actin Ebene normalisiert. Illustrative Filme für jede tight Junction Protein und Bedingungen werden im Bedienfeld “(F)” gezeigt. Expressionsgrad von NF-κB (G) und XIAP (H) in PBMCs Co mit Caco-2 Zellen kultiviert. Repräsentative Filme für NF-κB, XIAP und Aktin werden im Fenster angezeigt. Jeder Wert ist der Mittelwert von ≥3 unabhängigen Experimenten ± SEM Grafiken angepasst von Morini Et Al. 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Kolorektales Karzinom, mit seiner hohen Vorkommen in den entwickelten Ländern, ist eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung. Es wird in der Regel von Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie1. Im Rahmen der Strahlentherapie Behandlungen muss die Auswirkungen von gesundem Gewebe Exposition4besondere Aufmerksamkeit gewidmet; Darüber hinaus sind systematische Studien über das Verhältnis zwischen Strahlenbelastung und das Immunsystem von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von Ansätzen der Radio-Immuntherapie3.

Die Methodik, die wir in dieser Arbeit angenommen wurde auf die Untersuchung von Caco-2 Zellen und PBMC Übersprechen zugeschnitten. Wir konzentrierten uns auf die Wirkung der Röntgenstrahlen Exposition von Tumorzellen, aber das gleiche Protokoll an Studien mit pharmakologischer Substanzen angepasst werden kann. Näher an physiologischen Bedingungen in Bezug auf die Standardzelle zu züchten ist, der Vorteil dieser Methode die Möglichkeit, eine komplette Zerlegung eines komplexen Systems, die Möglichkeit der Analyse von verschiedenen Zelltypen und die Freisetzung von Signalmoleküle in die beiden Fächer der Co Kultur selbst. Auf diese Weise können routinemäßig angewandte biologischen Methoden das Verständnis der zellulären Verwandte Mechanismen Zusammenspiel helfen.

Die erste Charakterisierung von X-ray-induzierte Effekte auf Caco-2 Zellen beruhte auf zwei ergänzende Messungen, d. h. die farbmetrischen MTT-Assay und der Trypan blauen Farbstoff Ausschluss testen. Die scheinbar inkonsistente Ergebnisse konnte durch die unterschiedlichen Schwerpunkten von diesen beiden Assays erklärt werden. MTT bewertet die Oxidoreductase Enzyme Aktivität, während die Trypan blauer Farbstoff auf einer lebenden Zelle Ausschlussmechanismus Farbstoff basiert.

Die Untersuchung der Caco-2-PBMC Zusammenspiel erfordert die Erstellung einer epithelialen monomolekularen Film in der Lage, eine vollständige Trennung zwischen die beiden Fächer der Co-Kultur führen. Die Möglichkeit der Aussaat Caco-2 Zellen in Kokultur einfügen erlaubt die Bestrahlung nur diese Zellpopulation. Da der Kokultur nach Bestrahlung beginnt, gibt es keine Verzerrung aufgrund keine versehentlichen Exposition von PBMC. Dieses Set-up muss sorgfältig behandelt werden, zur Vermeidung von Schäden (oder Verschmutzung) der zellulären monomolekularen Film während der Bewegungen des Einsatzes von einer 6-Well-Platte auf die andere. Wenn sorgfältig ausgeführt, sind TEER-Messungen eine einfache und nicht-invasive Methode, die Monolayer-Durchlässigkeit zu untersuchen. Dieser Assay ist eng mit der Kokultur Aufbau, und es ist nicht die einzige Wahl für die Untersuchung der Monolage Durchlässigkeit. Es ermöglicht eine gute Reproduzierbarkeit der Maßnahmen, sobald es gut mit frischen kompletten Medium kalibriert ist. Gemeinsame Tests konzentrieren sich auf die Verbreitung von chemischen Farbstoffen aus dem oberen “apikalen” Fach auf der Unterseite “basolateralen” eine (z. B. Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran-Assay)16. Jedoch da PBMC befinden sich in der basolateralen Fach in dieser Studie, beschlossen wir, die Einführung von chemischen Reagenzien in den Experimenten zu vermeiden.

Unter den verschiedenen Techniken, die in dieser Arbeit angenommen ist TEER-Messung das einzige, das der Kokultur Aufbau17,18erfordert. Jedoch bieten die anderen gemeinsamen Labortechniken aussagekräftigere Ergebnisse, wenn Zellen in Kokultur, zugewiesen, da sie die Untersuchung von einem Setup näher an physiologischen Bedingungen ermöglichen und die Daten eine stärkere biologische Bedeutung haben. Auf der anderen Seite ist zu beachten, dass die Verwendung von Zellen auf einem porösen Träger angebaut, einige Schwierigkeiten in der Vorbereitung der Proben, wie z. B. die lyse der Zelle für die Zubereitung von Zellextrakten durch western Blot analysiert werden musste führen könnte.

Das System in dieser Studie hat das Potenzial, weiter verbesserte, z. B. mit der Anwendung von Substanzen in der Lage, die extrazelluläre Matrix Milieu neu sein. Aber dadurch wird auch eine erhöhte Komplexität des Systems, und eine komplette Zerlegung des Aufbaus werden schwieriger zu erreichenden.

Setups für Zellkultur Co stellen sicherlich ein mächtiges Werkzeug zur Förderung der in-vitro- Forschung und für das Verständnis von komplexen Systemen. Diese Technik hat das Potential, das Wissen über grundlegende Mechanismen, neue Eingaben für grundlegende Untersuchungen auf molekularer Signalisierung und mit möglichen Anwendungen für die Modulation der Aktivität des Immunsystems im Rahmen der erhöhen onkologischen klinischen Patientenmanagement.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Italienisches Institut für Kernphysik (INFN) finanziert teilweise diese Arbeit durch das INFN-MERIDIAN-Projekt. Die Autoren erkennen für INFN-MERIDIAN Projektkoordination Prof. Edoardo Milotti (Fachbereich Physik, Universität von Triest, Italien); Dr. Roberto Chignola (Biotechnologie-Abteilung, Universität von Verona, Italien) für die Bereitstellung der Caco-2 Zellen, das Ohmmeter und für seine wertvolle Hilfe und Training. Wir anerkennen auch Agnese Solari für technische Hilfe.

Materials

ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates		 Greiner Bio-one 657610 Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well  Greiner Bio-one 657160 Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well  Greiner Bio-one 662160 Plastic
RPMI 1640 without L-Glutamine Lonza 12-167F Reagents
Foetal Bovine Serum Lonza DE14-801 Reagents
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605C Reagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10K Lonza 17-602E Reagents
CO2 Incubator Heal Force HF240 Equipment
Ficoll Histopaque-1077 Sigma-Aldrich 10771 Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 227261 Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 188261 Plastic
Centrifuge ThermoScientific CL31R Equipment
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS Greiner Bio-one 690175 Plastic
Clinac 2100 Linear Accelerator Varian CLINAC 2100C/D Equipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Reagents
Multiwell Plate Reader GDV DV990BV6 Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 %  Amresco K940 Reagents
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049 Reagents
1.5 mL tubes Eppendorf 0030125150 Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter Millipore MERS 00001 Equipment
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signalling Technology #9803 Reagents
Bürker Hemocytometer Sigma-Aldrich BR719520 Equipment
BCA Protein Quantification Kit Abcam ab102536 Reagents
2x Laemmli Sample Buffer  BioRad #1610737 Reagents
2-Mercaptoethanol  BioRad #1610710 Reagents
Accublock Digital Dry Bath Labnet International Inc. D1100 Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL BioRad #4568093  Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel BioRad #1658004 Equipment
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad #1645052  Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards BioRad #1610385  Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer BioRad #1610732  Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BioRad #1704156 Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad #1704150 Equipment
Blotting-Grade Blocker  BioRad #1706404 Reagents
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773 Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #13255 Reagents
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906 Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #8193 Reagents
ZO-2 Antibody  Cell Signalling Technology #2847 Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb Cell Signalling Technology  #13531 Reagents
Anti-Occludin Antibody Millipore ABT146 Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] Abcam ab32536 Reagents
Anti-XIAP antibody  Abcam ab21278 Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare Life Sciences NA931V Reagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare Life Sciences NA934V Reagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL BioRad #1705060  Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher Sigma-Aldrich P7042 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher Sigma-Aldrich P7167 Reagents
Carestream Kodak BioMax light film Sigma-Aldrich Z370401 Reagents
Gel Doc EZ System BioRad #1708270  Equipment
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References

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Babini, G., Morini, J., Barbieri, S., Baiocco, G., Ivaldi, G. B., Liotta, M., Tabarelli de Fatis, P., Ottolenghi, A. A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC. J. Vis. Exp. (131), e56908, doi:10.3791/56908 (2018).
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