Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.
Protein toplama Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) de dahil olmak üzere çoğu nörodejeneratif hastalıkların merkezi bir özellik olur. Protein toplamları nevropatoloji bu hastalıklarda ile yakından ilişkili olmakla birlikte hangi normal hücresel homeostazı anormal protein toplama bozan kesin mekanizması bilinmiyor. Veri ortaya çıkan güçlü bir destek hipotez için reklam, PD, HD o patojenik toplamları sağlayan, ve ALS Prionlar, sadece protein bulaşıcı ajanlar için bulaşıcı spongiform Encephalopathy sorumlu birçok benzerlikler. Prionlar şablonu tarafından yerel olarak katlanmış sürümleri toplama fenotip yayılmasını neden aynı Protein çevrimi kendini çoğaltır. Nasıl Prionlar ve deli dana gibi proteinler yılında, PD, HD ve ALS bir hücreden diğerine harekettir şu anda yoğun araştırma alanıdır. Burada, deli dana gibi hücre hücre iletim HD ile ilişkili mutant huntingtin (Htt) toplamları izleme izni Drosophila melanogaster modeli kullanılmıştır. Bu model birçok farklı Drosophila dokularda transgene ifade değiştirmek için güçlü araçlar yararlanır ve doğrudan rapor deli dana benzeri transfer mutant Htt toplamları fluorescently öğesini sitoplazmik protein kullanır. Önemlisi, biz burada tarif yaklaşım roman genler ve protein toplamları farklı hücre türleri içinde vivoarasında yayılan aracılık yollar tanımlamak için kullanılabilir. Bu çalışmalardan elde edilen bilgilerden nörodejeneratif hastalıkların altında yatan ve terapötik müdahale için yeni fırsatlar ortaya patojenik mekanizmaların sınırlı anlayış genişletir.
Deli dana hipotez devletlerin bulaşıcı transmissible spongiform Encephalopathy (örneğin, Creutzfeldt – Jakob hastalığı insanlarda, koyun, geyik ve elk kronik israf hastalığı ve “deli dana hastalığı” sığır büyük sorumlu ) sadece protein ve nükleik asitler1yoksun oluşmaktadır. Prion hastalıkları, hücresel prion protein (PrPC) son derece beta sayfa zengini ve dönüştürme ve monomeric PrPC molekülleri istikrarlı amiloid işe alma tarafından kendi kendine yayabilirsiniz bir yerel olmayan, istikrarlı kat (PrPSc) varsayar. toplar. PrPSc toplamları bu kendini çoğaltan mekanizması bir canlı farklı hücreler arasında ve hatta bireysel organizmaların2arasında yaymak için kullanın.
Protein misfolding ve toplama Ayrıca merkezi bir özelliğidir çoğu nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS))3. Bu hastalıklar derlemelerde içi veya ekstra cellular toplanan protein oluşumunu saat5, yakından ile sitotoksisite4 ve beyin ile son derece tekrarlanabilir ve hastalığa özgü yolları boyunca ilerledikçe ilişkilidir 6. patojen toplamları bu bozuklukları ile ilişkili deli dana gibi özelliklere sahip bu kalıpları yayılan öneririz. Şimdi güçlü desteği vardır deli dana gibi iletim reklam ile ilgili toplamları için PD, HD ve ALS – onlar yaymak hücre-hücre ve şablon monomeric formları daha önce etkilenmemiş hücreleri7, aynı proteinin konformasyon Değiştir 8.
Deli dana gibi protein toplamları bugüne yayılmasını araştıran çalışmalar çoğunluğu memeli hücre kültür modelleri, ekstrasellüler boşluk veya başka bir hücrenin toplamları saf hücre sitoplazma nerede Aktarım’ı kullanarak gerçekleştirilen sitoplazma9,10,11,12,13,14,15, veya toplama içeren malzeme fare beyin enjekte ve izleme Toplu Görünüm dışında Enjeksiyon Makinası16,17,18,19,20,21,22, 23. son zamanlarda Transjenik hayvanlar sağlam beynini24,25,26,27, içinde diğer hücrelere yayılan hücre içi toplamları göstermek için kullanılmıştır 28,29,30. Burada, doğrudan görselleştirme Drosophila melanogastersağlam beynini tek tek hücreleri arasında toplu aktarım için bir yöntem açıklanmaktadır. Drosophila modelleri HD/polyglutamine (polyQ) hastalıkların ilk geliştirilmiş olup, tüm yaklaşık iki yıl önce31,32 ve bu bozuklukların altında yatan patojenik mekanizmaların birçok çok değerli anlayışlar hazırladık 33. HD için protein huntingtin (Htt)34kodları gen bir otozomal dominant mutasyon neden bir devralınan nörodejeneratif bozukluğu olduğunu. Genişleme polyQ abartılı Htt’ın N-terminus bir patojen eşiğinde ötesinde yakınındaki bu mutasyon sonucunda ~ misfold ve toplam35,36protein neden 37 glutamines. Vahşi-türü Htt protein içeren < bu streç içinde 37 glutamines kendi yerel kat elde, ama için indüklenen bir Htt toplama "tohum"12,27,37ile doğrudan fiziksel temas üzerine toplamak. Biz bu homotipik, vahşi tipi Htt çekirdekli toplama deli dana benzeri transfer için bir okuma olarak ve diğer hücrelerde kaynaklanan mutant Htt toplamları sitoplazmik giriş yararlanmak.
Mekanizmaları göre hangi deli dana gibi toplamları belirleme seyahat hücreler arasında tedavi edilemez nörodejeneratif hastalıklar için yeni tedavi hedefleri tanımlaması yol açabilir. Biz almak avantajı hızlı yaşam döngüsünün, kullanım kolaylığı ve hücre-hücre mutant Htt toplamları yayılması için moleküler mekanizmaları tanımlamak için Drosophila melanogaster genetik tractability. Deneysel stratejimiz iki ikili ifade sistemleri Drosophila, köklü Gal4 özgü ters yönde harekete geçirmek sıra (Gal4-UAS) sistem38 ve son zamanlarda geliştirilen QF-QUAS sistemi39uygun kullanmaktadır. Bu iki bağımsız sistem kaplin mutant ve vahşi-type Htt transgenes ifadesi aynı sinek40içinde farklı hücre popülasyonlarının sınırlama sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, biz normalde diffüz, çözünür durumuna gelen sitoplazmik vahşi tipi Htt toplanan bir devlet, önceden biçimlendirilmiş bir mutant Htt ile fiziksel temas doğrudan bir sonucu yeniden dağıtılması izleyerek mutant Htt deli dana gibi yayılan incelemek toplama “tohum.” Biyokimyasal kullanarak dönüşüm vahşi tipi Htt mutant Htt tarafından onaylanabilir veya floresan rezonans enerji gibi protein-protein etkileşimleri rapor biyofiziksel teknikleri (FRET)9,27,41 transfer .
Da önemlisi, aynı zamanda genetik genler ve/veya protein toplamları yayılmasını deli dana benzeri aracılık yolları tanımlamak için Drosophila araçlarında çok sayıda erişebilirsiniz. Biz son zamanlarda önemli bir rol için hücre yüzey çöpçü reseptör, mutant Htt toplamları Drosophila Merkezi yakındaki fagositik glia nöronal aksonlar aktarılması içinde Draper42,43, açıklayacak bu yaklaşım kullanılan sinir sistemi (MSS)27. Böylece, biz burada tarif genetik ve görüntüleme tabanlı yaklaşım için kullanımı kolay ama güçlü model organizma, Drosophilahastalık ilgili bir fenomen hakkında önemli temel biyolojik bilgi ortaya çıkarabilir.
Nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip hastaların sayıları artmaya devam ettikçe, böylece daha iyi tedaviler geliştirilen bu hastalıkların moleküler patogenezi anlayışı artırmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, patojenik protein toplamları model organizma, Drosophila melanogasterfarklı hücre türleri arasında deli dana gibi iletimi izlemek için izin yöntemleri açıklanmaktadır. Biz son zamanlarda mutant Htt toplamları vivo içinde iletimini deli dana gibi göstermek ve n…
The authors have nothing to disclose.
Bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında birçok yararlı tartışmalar Kopito, Luo ve Pearce Labs’in üyeleri teşekkür ediyoruz. Biz de bu el yazması eleştirel okuma için Brian Temsamrit teşekkür ederim. Bu eser Üniversitesi Bilimler ve chilling Smith hayırsever güven fonlarından desteklenen bir durumdu.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |