초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링
Summary
병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.
Introduction
프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 “광우병” 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산1없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrPC) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrPC 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrPSc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체2사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.
단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다3. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간5, 에 밀접 하 게 관련 된 세포 독성4 와 두뇌를 통해 높은 재현성 및 질병 특정 경로 따라 진행 6. 이러한 패턴의 확산이이 질환과 관련 된 병원 성 집계 프리온 같은 속성을가지고 제안. 강력한 지원, 광고와 관련 된 집계의 프리온 같은 전송에 대 한 존재 PD, HD, 및 ALS-그들은 셀 템플릿 이전 영향을 받지 않는 셀7, 동일한 단백질의 단위체 형태의 구조적 변화에서 확산 8.
날짜의 단백질 프리온 처럼 확산 조사 연구의 대다수 포유류 세포 문화 모델, 어디 집계 전송을 사용 순진한 세포의 세포질에 다른 세포 또는 세포 외 공간에서 수행 되었습니다. 세포질9,10,11,12,13,,1415, 또는 마우스 두뇌에 집계 포함 된 재료를 주입 하 고 모니터링 하 여 집계는 사출 사이트16,17,18,19,20,,2122, 이외의 모양 23. 최근 유전자 변형 동물 세포내 집계 그대로 두뇌24,25,,2627, 내의 다른 셀에 확산을 보여 주기 위해 사용 되었습니다 28,,2930. 여기, 우리는 초파리 melanogaster의 그대로 뇌에 있는 개별 셀 사이의 집계 전송의 직접 시각화 하는 방법을 설명합니다. 초파리 모델 HD/polyglutamine (polyQ) 질병의 거의 2 년 전 처음 개발31,32 이 무질서의 기반이 되는 병원 성 메커니즘에 대 한 많은 귀중 한 통찰력 제공 33. HD는 단백질 huntingtin (Htt)34코드 하는 유전자는 상 염색체 지배적인 돌연변이 의해 발생 하는 상속 된 신경 장애. 이 돌연변이의 병원 문 턱을 넘어 Htt의 N-말단 근처 polyQ 스트레치의 확장 결과 ~ 37 glutamines, misfold 및 집계35,36단백질을 일으키는. 야생-타입 Htt 단백질 포함 된 <이 뻗 기에 37 glutamines 그들의 네이티브 배를 달성 하지만에 유도 될 수 있다는 Htt 집계 "씨앗"12,,2737와 직접적인 물리적 접촉 시 집계. 우리는이 homotypic, 프리온 같은 전송에 대 한 판독으로 야생-타입 Htt의 nucleated 집계 및 다른 세포에서 발생 하는 돌연변이 체 Htt 집계의 세포질 항목을 악용 합니다.
프리온 같은 집계 하 여 결정 하는 메커니즘 셀 사이의 여행 불 치 신경 퇴행 성 질환에 대 한 새로운 치료 대상의 식별 될 수 있습니다. 우리는 빠른 라이프 사이클을 이용, 사용의 용이성, 그리고 초파리 melanogaster 돌연변이 체 Htt의 셀을 확산에 대 한 분자 메커니즘 정의를 유전적 추적성을 걸릴. 우리의 실험 전략 초파리, 잘 설립 Gal4 특정 상류 활성화 순서 (Gal4 UAS) 시스템38 및 QF QUAS 최근 개발 시스템39에서 사용할 수 있는 두 개의 이진 식 시스템을 사용합니다. 이 두 개의 독립적인 시스템을 커플링 같은 비행40내 뚜렷한 세포 인구를 제한 하는 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 표현 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 프리온 같은 집계 된 상태로, 미리 형성 된 돌연변이 체 Htt와 육체적 인 접촉의 직접적인 결과 일반적으로 확산, 수용 성 상태에서 세포질 야생-타입 Htt의 재분배를 모니터링 하 여 돌연변이 Htt의 확산 검토 집계 “씨입니다.” Htt의 돌연변이 의해 야생-타입 Htt의 변환 생물을 사용 하 여 확인 될 수 있다 또는 단백질 단백질 상호 작용, 형광 공명 에너지 등을 보고 생물 기술 전송 (무서 워)9,,2741 .
중요 한 것은, 우리 또한 많은 유전자 초파리 유전자 및 단백질의 프리온 같은 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 도구를 액세스할 수 있습니다. 우리는 최근 세포 표면 폐품 수용 체, 드레이퍼42,43, 신경 축 삭에서 초파리 중앙에 가까운 phagocytic 명과 돌연변이 체 Htt 집계를 전송에 대 한 중요 한 역할을 공개 하기 위해이 접근을 사용 신경 시스템 (CNS)27 따라서, 우리가 여기에 설명 하는 유전 및 이미징 기반 접근 강력한 모델 생물, 초파리하지만 사용 하기 간단한에서에서 질병 관련 현상에 대 한 중요 한 기본적인 생물 학적 정보를 밝힐 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 방법을 개발 하는 동안 많은 도움이 토론을 위한 Kopito, 루 오, 그리고 피어스 연구소의 회원을 감사합니다. 우리는 또한이 원고에의 중요 한 독서에 대 한 브라이언 Temsamrit을 감사합니다. 이 작품은 대학 과학 및 트 면 스미스 자선 신탁에서에서 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
| Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
| FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
| Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
| LAS X image analysis software | Leica | ||
| Imaris image analysis software | Bitplane |
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