تتراكم الأدلة تؤيد فكرة أن المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض الأعصاب تنتشر بين الخلايا التي تحتوي على خصائص مثل بريون. هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للتصور من خلية إلى خلية انتشار بريون مثل المجاميع في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية.
تجميع البروتين سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض). البروتين المجاميع ترتبط ارتباطاً وثيقا بأمراض الأعصاب في هذه الأمراض، وعلى الرغم من أن الآلية الدقيقة الذي يعطل تجميع البروتين الشاذة التوازن الخلوية العادية غير معروف. تظهر البيانات تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن المجاميع المسببة للأمراض في الإعلان، PD، هد، والمرض لديها الكثير من أوجه التشابه إلى البريونات، وعوامل معدية البروتين فقط مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي. الذاتي تكرار البريونات بقولبة تحويل الإصدارات مطوية أصلاً من البروتين نفسه، مما تسبب في انتشار النمط الظاهري التجميع. كيف البريونات وبروتينات بريون الشبيهة في الإعلان، تحرك PD، عالية الدقة، والمرض من خلية واحدة إلى آخر في الوقت الراهن مجالاً لتحقيقات مكثفة. ويرد هنا، نموذج melanogaster المورفولوجية التي تسمح برصد انتقال بريون–مثل، خلية إلى خلية هونتينجتين المسخ (Htt) المجاميع المرتبطة بهد. هذا النموذج يأخذ استفادة أدوات قوية لمعالجة التعبير التحوير في العديد من الأنسجة المورفولوجية المختلفة ويستخدم بروتين هيولى معلم فلوريسسينتلي مباشرة التقرير بريون مثل نقل متحولة Htt المجاميع. الأهم من ذلك، يمكن استخدام النهج الذي يصف لنا هنا لتحديد الجينات الجديدة والمسارات التي تتوسط نشر المجاميع البروتين بين أنواع الخلايا المتنوعة في فيفو. المعلومات المكتسبة من هذه الدراسات سيتم توسيع الفهم المحدود للآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء أمراض الأعصاب، وتكشف عن فرص جديدة للتدخل العلاجي.
بريون فرضية تنص على أن الوكيل المعدية مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي (مثلاً، كروتزفيلد-جاكوب لدى البشر، والرعاش في الخراف ومرض الهزال المزمن في الأيائل والغزلان “مرض جنون البقر” في الماشية ) تتألف فقط من البروتين وخالية من الأحماض النووية1. في أمراض بريون، يفترض بروتين بريون الخلوية (PrPج) حظيرة غير أصلية، ومستقرة (PrPSc) هو درجة عالية من بيتا الغنية بورقة، ويمكن نشر الذاتي بتحويل وتوظيف أحادي الحزب الثوريج الجزيئات في اميلويد مستقرة المجاميع. PrPاتفاقية استكهولم تجميعات استخدام هذه الآلية ذاتية لتنتشر بين خلايا مختلفة في الكائن حي، وحتى بين الكائنات الفردية2.
بروتين ميسفولدينج والتجميع أيضا سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب (مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض))3. تشكيل جمعيات البروتين مجمعة داخل أو خارج الخلايا في هذه الأمراض يرتبط ارتباطاً وثيقا سيتوتوكسيسيتي4 ، وتقدم على طول مسارات استنساخه للغاية وخاصة بالمرض عن طريق الدماغ على مر الزمن5، 6-أنماط انتشار هذه توحي بأن المجاميع المسببة للأمراض المرتبطة بهذه الاضطرابات خصائص مثل بريون. الآن يوجد دعم قوية لانتقال بريون مثل المجاميع المرتبطة بالإعلان، PD، عالية الدقة، والمرض–أنها تنتشر من خلية إلى خلية وقالب تغيير أحادي أشكال البروتين نفسه في خلايا تتأثر سابقا7، كونفورماشونال 8.
وقد أجريت معظم الدراسات التحقيق في انتشار بريون مثل المجاميع البروتين إلى تاريخ استخدام نماذج الثقافة خلية الثدييات، حيث نقل المجاميع في السيتوبلازم للخلايا ساذجة من الفضاء خارج الخلية أو من خلية أخرى السيتوبلازم9،10،11،،من1213،،من1415، أو عن طريق حقن المواد المحتوية على التجميع في أدمغة الفأر والرصد تجميع مظهر خارج حقن الموقع16،17،،من1819،20،21،22، 23. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الحيوانات المحورة وراثيا لإثبات أن تنتشر مجاميع داخل الخلايا إلى خلايا أخرى ضمن العقول سليمة24،25،،من2627، 28،،من2930. هنا، نحن تصف طريقة للتصور مباشرة لنقل الكلي بين خلايا فردية في الدماغ سليمة من melanogaster المورفولوجية. أولاً وضعت نماذج المورفولوجية للأمراض عالية الدقة/بوليجلوتاميني (polyQ) منذ ما يقرب من عقدين من الزمان32 من31،، وقد قدم العديد من الأفكار لا تقدر بثمن في الآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء هذه الاضطرابات 33-عالية الدقة هو اضطراب الأعصاب موروثة الناجمة عن طفرة مهيمنة جسمية في الجينات التي رموز ل البروتين هونتينجتين (Htt)34. نتائج هذه الطفرة في التوسع في امتداد polyQ قرب ن-تيرمينوس ل Htt تتجاوز عتبة المسببة للأمراض من ~ جلوتامينيس 37، يسبب البروتين ميسفولد و إجمالي35،36. البرية من نوع Htt البروتينات التي تحتوي على < جلوتامينيس 37 في هذا الامتداد تحقيق على إضعاف الأصلي، ولكن يمكن أن يتسبب للتجميع عند الاتصال الجسدي المباشر مع Htt تجميعية "البذور"12،،من2737. يمكننا استغلال هذه هوموتيبيك، تجميع Htt البرية من نوع الأنوية كقراءات لنقل مثل بريون ودخول هيولى متحولة Htt المجاميع الصادرة في الخلايا الأخرى.
تحديد الآليات بالمجاميع التي تشبه بريون السفر بين الخلايا يمكن أن يؤدي إلى تحديد أهداف علاجية جديدة للأمراض المستعصية الأعصاب. ونحن اتخاذ استفادة دورة حياة سريعة، وسهولة الاستخدام، والمقاييس الوراثية من melanogaster المورفولوجية لتحديد الآليات الجزيئية لخلية إلى انتشار متحولة Htt المجاميع. لدينا استراتيجية تجريبية توظف التعبير ثنائي نظامين متاحة المورفولوجيةوالراسخة الخاصة Gal4 المنبع تفعيل تسلسل (Gal4-UAS) نظام38 ووضعت مؤخرا QF-QUAS نظام39. اقتران هذين النظامين مستقلة يسمح تقييد التعبير عن المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع للسكان خلية متميزة داخل يطير نفسه40. باستخدام هذا النهج، علينا أن ندرس بريون مثل نشر متحولة Htt برصد إعادة توزيع هيولى Htt البرية من نوع من حالته عادة منتشر، والقابلة للذوبان إلى حالة مجمعة، كنتيجة مباشرة للاتصال الجسدي مع متحولة سابق تشكيل Htt تجميع “البذور”. يمكن تأكيد تحويل Htt البرية من نوع من المسخ Htt باستخدام الكيمياء الحيوية أو نقل التقنيات الفيزيائية الحيوية التي تقرير تفاعلات البروتين البروتين، مثل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)9،،من2741 .
الأهم من ذلك، يمكننا أيضا الوصول إلى عدد كبير من الأدوات الجينية في المورفولوجية لتحديد الجينات و/أو المسارات التي تتوسط بريون مثل انتشار المجاميع البروتين. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النهج لكشف النقاب عن دور رئيسي لمستقبلات الكاسح سطح الخلية، دريبر42،43، في نقل متحولة Htt المجاميع من محاور عصبية العصبية لإطلاق متجولة القريبة في المورفولوجية المركزية الجهاز العصبي (CNS)27. وهكذا، يمكن أن تكشف عن النهج الوراثية التصوير القائم والذي يصف لنا هنا المعلومات البيولوجية الأساسية الهامة حول ظاهرة ذات صلة بمرض في البسيطة الاستخدام لكنها قوية طراز الكائن الحي، و المورفولوجية.
كما أن عدد المرضى الذين يعانون من أمراض الأعصاب تواصل الازدياد، هناك حاجة ملحة زيادة فهم الآلية المرضية الجزيئية لهذه الأمراض بحيث يمكن تطوير علاجات أفضل. هنا، نحن تصف الأساليب التي تسمح لرصد انتقال بريون مثل المجاميع البروتين المسببة للمرض بين أنواع الخلايا المختلفة في نموذج الكائن الح…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء مختبرات كوبيتو ولو بيرس للعديد من المناقشات مفيدة أثناء تطوير هذه الأساليب. ونشكر أيضا تيمسامريت ريان لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. الأموال من جامعة العلوم وصناديق خيرية سميث قد أيد هذا العمل.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |