תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

1. תרבות, תיוג מטבולית לתקוע פעם למרכז הכיפה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי עם מחט אל תדאגי כדי לאפשר אוורור נאות. לחסן µL 500 של שהושלם סטרילי 7 שעות 9 מרק עם 5 µL של smegmatis מ מ starter תרבות מבוגר לילה12.הערה: את המתכון ליטר אחד של 7 שעות 9 הוא ציר: 4.7 g מסחרי H 7 9. אבקה, 2 מ ל גליצרול, 1 מ”ל Tween 80, g 0.85 NaCl, 5 g אלבומין, 2 גרם דקסטרוז, H2O (להביא את הנפח הכולל עד 1 ליטר). (זהירות) בעקבות שיטות המכון להגנת סטנדרטי, ספייק התקשורת תרבות עם µCi/mL 20 [32P] נה2HPO4. לגדול חיידקים על העצבנות 37 ° C ו- 1,200 סל ד, ב חממה שאכר מאחורי מגן אקרילי בעובי 9 מ מ. בשלב midlog (O.D.600 ננומטר ~ 0.5), להעביר את תרבות שלמה לתוך צינור 2-mL בורג-קאפ ואת הצניפה חיידקים רדיואקטיבי בטמפרטורת החדר על ידי צריך שתוציאו במשך 2 דקות ב- 10,000 x ג לאסוף supernatant האורטו רדיואקטיבי המכיל טריטוריה ב פח אשפה המתאים. 2. הכנת RNAs סה הערה: RNAs הכולל המחולצים כדורי חיידקי באמצעות ריאגנט החילוץ RNA מסחרי (מכיל guanidinium thiocyanate, פנול, כלורופורם) ע פ הפרוטוקול של היצרן. להוסיף 1 מ”ל של ריאגנט החילוץ RNA מסחרי ו כ-200 µL של חרוזי זכוכית על גבי בגדר. קאפ הצינור בצורה מאובטחת, לשבש את בקטריאלי ב מהמגן למשך 2 דקות תחת עצבנות המרבי, (קביעת מספר חמש על המכשיר שבחרת (ראה את הטבלה של חומרים)). צנטריפוגה מדגם ב g x 12,000 10 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור 2-mL וזורקים את החרוזים כראוי. להוסיף 0.2 מ של כלורופורם, לנער צינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס’ 15 ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. לאסוף את פאזה מימית של המדגם לתוך צינור חדש על ידי לדוג את הצינור ב- 45 מעלות. להימנע מהדפסת לאטמוספרה או שכבה אורגני. להוסיף 2 µL של precipitant בצבע ו- 0.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל 100%. לנער את הצינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס’ 5 ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע מהצינור ולמחוק כראוי כפי השבר נוזלי עשוי להכיל עקבות של קרינה רדיואקטיבית. אוויר יבש גלולה עבור 5 דקות ואז resuspend ב 200 µL של 2 X תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס), 0.1% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) הסופי.הערה: ההרכב של המניה 20 X האס הוא 3.0 M NaCl, 0.3 M סודיום ציטרט, pH 7.0. 3. הכנת לוחות מדפסת טוב 96 הערה: מיקרו-מערכים tRNA מודפסים באופן ידני עם ארבעים ושניים 70-מר דנ א משלים 3′ בסוף כל tRNA smegmatis מ’ (מסוף המרכז לאמנות עכשווית נכלל) באמצעות arrayer 8 פינים של oligonucleotides. מסדרות את הגששים oligonucleotide דנ א, כמו גם את הפריסה החוקרת את הצלחת-. ובכן, את המערך מסופקים (1 קובץ משלים – גיליון 1 עד 3 בהתאמה). עיצוב ה-DNA רגשים הראשון רצפים tRNA איחזור או גנים קידוד tRNA ממסדי tRNA כגון tRNA גנומית מסד הנתונים13. לקצץ שנשמרת 3′ סוף המרכז לאמנות עכשווית, אם מקודד. הפוך משלים הרצף שנוצר. . בדיקת סדר בהתבסס על נוקלאוטידים תחילה 70 Resuspend יבש DNA הגששים במים. להתאים את הגששים ריכוז 100 מיקרומטר. ב- 96 טוב-צלחת, להכין µL 120 של 50 מיקרומטר oligos ב 3 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות הסופי (שתדללו 60 µL של הגששים מניות בודדות היטב עם 60 µL של 6 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות. מכסים בצלחת בנייר כסף כדי למנוע אידוי או זיהום, להקפיא מיידית ולשמור ב-20 ° C עד שהוא נדרש. 4. מערך ההדפסה להפשיר את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (לוקח בערך 20 דקות). תווית שקופיות זכוכית מצופים אמין עם עט יהלום. במקום מגלשות לתוך יחידה יצירת אינדקס. בצע את מיקומי רשת, לעשות כדלקמן. בזהירות טובלים הפינים משכפל הבארות. הדפס בעדינות את המערך בשקופיות זכוכית, באמצעות לחץ מינימלי (אתם תרגישו התנגדות קטנה). להמשיך בהדפסה ללא ניקוי את arrayer עד גמר עם בלוק א כשתהיה מוכן להמשיך הלאה הבלוק הבא, בצע את ההליך כביסה המתוארים להלן. טובלים משכפל לבן 5% ומנערים בעדינות. לחץ משכפל לנייר סופג. טובלים משכפל במים מזוקקים, לנער בעדינות, והקש לתוך נייר. חזור על שלב זה פעם אחת. טובלים משכפל ב אלכוהול איזופרופיל, לנער בעדינות, והקש לתוך העיתון. יבש המשכפלים על המאוורר עבור 20 s לפני שהמשכנו הבלוק הבא של צלחת 96-ובכן. להמשיך מספר הדפסים הרצוי. לאפשר את השקופיות להתייבש ואז crosslink oligos אל השקופית באמצעות crosslinker UV של 254 ננומטר. הגדר את רמת האנרגיה µJ/cm 999,9902. לשים את הפנים שקופיות על משטח נקי ב crosslinker. לחץ על “התחל”. לחסום את מערכי לילה ב 450 מ של חסימת פתרון על פגים, בטמפרטורת החדר ותחת עצבנות איטי. לאסוף ולהשתמש פתרון חסימה עד פי ארבעה.הערה: המתכון עבור הפתרון החסימה היא: 125 מ מ פוספט מאגר (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25% מרחביות (w/v), 0.5 מ מ EDTA, האס X 0.5, 1% BSA (w/v). לשטוף את השקופיות פי 2 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר 500 מ ל מים מזוקקים. יבש את השקופיות על-ידי צריך שתוציאו בשביל 10 s בטמפרטורת החדר ומפרידה microarray. מאגר מערכי במקום חשוך ויבש עד 6 חודשים. 5. מערך הכלאה לפני הכלאה השקופיות במים רותחים, שוטפים ומייבשים על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6). במקום מערך בתוך קלטת הכלאה וטען radiolabeled מדגם ה-RNA. להפעיל תחנת הכלאה-כביסה אוטומטיים הפארמצבטית המרבי. תוכנית השלבים להלן. אטמים תנאי למשך 2 דקות ב 75 º C. להציג את המכשיר ב 60 מעלות צלזיוס.Denature הגששים ודוגמאות 5 דקות ב- 90 ° C. Hybridize דוגמאות עבור h 3 ב 60 מעלות צלזיוס. לשטוף שקופיות ב 50 מעלות צלזיוס פעמיים עם 2 X האס, 0.1% (w/v) מרחביות, זרימה 10 s והחזק 20 ס’ שטיפת שקופיות ב 42 ° C פעמיים עם 0.1 X SSC, 0.1% מרחביות, זרימה 10 s והחזק שקופיות שטיפת ס’ 20-42 ° C פעמיים עם 0.1 X האס , זרימה 10 s ו- s להחזיק 20. יבש שקופיות על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6). 6. מערך כמת גלישת טקסט שקופיות באמצעות סרט פלסטיק דק. בדוק שקופיות לאות רדיואקטיבי בעזרת מונה גייגר על ההגדרה הרגישים ביותר שלה. חושפים את השקופיות על מסך פוספור אחסון במגרה חשיפה בטמפרטורת החדר במשך 10-90 h בהתאם עוצמת האות.הערה: כפי הרגישות של מוני גייגר משתנים בין מכשיר אחד למשנהו, פעמים חשיפה חייב להיות מותאם מדעית. סריקת שקופיות ברזולוציה 50 מיקרומטר, באמצעות phosphorimager. לכמת ולחסר רקע-עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה באמצעות תוכנה J תמונה חופשית משודרג עם פרופיילר microarray. לארגן, לעבד נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני אלקטרונית. צור מפות חום באמצעות כלי עיצוב מותנה. מייצגים לדוגמה כל אות בדיקה כשבר (המתבטא וניתן) של האות הכולל בדיקה.