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医学

Rutina de detección del método de micropartículas en las transfusiones de plaquetas

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56893
, , ,
1Research & Development,LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory,LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research,University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

Summary

Gestión de inventario de plaquetas basado en evaluación el contenido de micropartículas en concentrados de plaquetas es una nueva iniciativa de mejora de calidad en bancos de sangre del hospital. El objetivo es distinguir activados de plaquetas no activadas para optimizar el uso de plaquetas. Proporcionando las plaquetas no activadas a pacientes hemato-oncología podría reducir su alto riesgo a ser refractarios.

Abstract

Gestión de inventario de plaquetas basado en evaluación el contenido de micropartículas en concentrados de plaquetas es una nueva iniciativa de mejora de calidad para bancos de sangre del hospital. Fragmento de las células de micropartículas (MP) cuando están estresados. Componentes de la sangre y la sangre pueden contener fragmentos celulares de una variedad de células, especialmente de plaquetas activadas. Al realizar sus funciones como las células inmunes innatas y principales actores en la coagulación y la hemostasia, las plaquetas cambian de forma y generan micropartículas. Con dispersión ligera dinámica (DLS)-basado en detección de micropartículas, es posible distinguir activado (alta micropartículas) de desactivado (baja micropartículas) plaquetas en transfusiones y optimizar el uso de este producto sanguíneo escaso. La investigación anterior sugiere que las plaquetas no activadas para uso profiláctico en pacientes de Hematología-Oncología podría reducir el riesgo de convertirse en la refractaria y mejorar la atención al paciente. El objetivo de este método de proyección es distinguir habitualmente activados de plaquetas no activadas. El método descrito aquí describe los pasos a realizar para la gestión de inventario de plaquetas rutina en un banco de sangre hospital: obtención de una muestra de una transfusión de plaquetas, carga de la muestra en el capilar para la medición de DLS, realizar la DLS de prueba para identificar micropartículas y utilizando el contenido de micropartículas divulgado para identificar plaquetas activadas.

Introduction

El interés en micropartículas ha girado sobre todo alrededor de su participación en los procesos de comunicación y biológico célula a célula. 1 , 2 , 3 más recientemente, micropartículas han también atrajo interés como posibles marcadores diagnóstico tempranos de enfermedades autoinmunes y cardiovasculares. 4 , 5 micropartículas, las vesículas también conocido como extracelulares o exosomas, han sido ampliamente investigados por citometría de flujo. Lamentablemente, pese a esfuerzos para estandarizar los protocolos de citometría de flujo convencional no existe ningún consenso sobre el protocolo óptimo de uso. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

Aunque la citometría de flujo convencional puede caracterizar las subpoblaciones específicas de MP,11 tiene varios divulgado limitaciones. 11 , 12 , 13 , 14 algunas de estas limitaciones han sido tratados mediante láser de mayor potencia y detectores en un supuesto “opción de pequeñas partículas”,15,16 , así como detección en avance de 15 ° – 25 ° ángulo de dispersión y modificada vaina presión . 17 , 18 sin embargo, un método de cribado rápido y fácil de usar que puede ser combinado con estos métodos sofisticados sigue siendo necesario para utilizar micropartículas como marcadores de diagnóstico tempranos. Los niveles elevados de micropartículas son detectables en un tercio de los donantes de sangre normal19 y podrían indicar condiciones subclínicas. En consecuencia, los niveles de micropartículas alta en productos de la sangre donada pueden ser incompatibles con los receptores vulnerables. 20

Cuando las transfusiones de plaquetas, hay un riesgo de refractariedad no inmune – una condición en donde el cuerpo de un paciente rechaza transfusiones consecutivas y no permite una porción significativa de las plaquetas que circulan. 21 , 22 refractariedad inmune no puede resultar en desperdiciadas transfusiones, complicaciones de salud para pacientes, hospitales extendido y estancias. 23 transfusiones de plaquetas que contienen un número elevado de micropartículas pueden ser un factor que contribuye para el desarrollo de refractariedad no inmunes en pacientes vulnerables hemato-oncología. 20 es posible gestionar el inventario de plaquetas según la composición de las transfusiones de plaquetas por la investigación de micropartículas reduciendo así el riesgo para los pacientes vulnerables. Sin embargo, mayoría de micropartículas las pruebas requieren aislamiento de micropartículas de plaquetas5,12 o son de otra manera muy mano de obra intensiva24,25 y por lo tanto no se puede implementar sistemáticamente en el hospital bancos de sangre.

La técnica descrita aquí utiliza dispersión ligera dinámica (DLS) – también conocido como espectroscopia de correlación de fotones o cuasi-elástica dispersión de la luz. Durante décadas, dispersión ligera dinámica se ha ampliamente utilizada en la industria farmacéutica para caracterizar la droga formulaciones o emulsiones donde los tamaños de partícula están en el rango de sub-micron. 26 , 27 sin embargo, de que no están optimizados con herramientas desarrolladas para estas aplicaciones a productos de la sangre de pantalla. Se desarrolló un nuevo sistema DLS para superar limitaciones técnicas y dispersión de luz dinámica útil para la detección de las transfusiones de plaquetas. 28

Medidas de dispersión ligera dinámica se realizan iluminando las partículas suspendidas con luz laser y analizando la variación de tiempo de la intensidad de luz dispersada que es una consecuencia de las partículas en suspensión. Además, este método utiliza la relación inversa entre la velocidad de la partícula y el tamaño – mover rápidamente las partículas pequeñas y partículas grandes se mueven lentamente – para proporcionar información sobre la distribución de tamaño y concentraciones relativas de los componentes de la muestra. Utilizando DLS, micropartículas media puede cuantificarse radio contenido y media del componente de micropartículas. El contenido de micropartículas en el producto sanguíneo es dada como % MP basado en el área en el histograma medición de radios de partícula de 50-550 nm. Mientras que las partículas con radios inferiores a 50 nm son detectados por DLS y registrados por el sistema DLS, no están incluidos en % MP. En lugar de aislar a micropartículas de las plaquetas, la heterogeneidad de las transfusiones de plaquetas se determina basado en el contenido relativo de micropartículas y plaquetas en una muestra. De hecho, la relación de los picos de la plaqueta y micropartículas puede utilizarse para calcular la concentración absoluta del MP cuando se conoce el conteo de plaquetas. 19

El sistema DLS proporciona a profesionales de la salud con información cualitativa y cuantitativa sobre micropartículas encontradas en especímenes derivados de sangre humana o hemoderivados. La principal ventaja de la técnica descrita de DLS en técnicas alternativas como la citometría de flujo, microscopia electrónica, nanopartículas29 seguimiento análisis30 o pulso resistente ajustable detección31 es la preparación de la muestra: alícuotas de concentrados de plaquetas se pueden medir directamente sin la necesidad de aislar la MP de las plaquetas, dilución de la muestra u otras modificaciones. 9 , 17 además, DLS es un método de medición absoluta y no sufre de la falta de granos de la calibración con índice de refracción apropiado. 14 , 32

Una correlación entre el contenido del MP y la activación plaquetaria se ha demostrado previamente por microscopía33,20 y puede inferirse del aumento en contenido de MP en condiciones patológicas15,34, 35 , 36 y las condiciones en vitro conocido para activar las plaquetas. 19 , 37 , 38 sin embargo, se necesitan más estudios para comprender totalmente la relación de activación de contenido y de la plaqueta de micropartículas DLS-medido. Basado en nuestros conocimientos actuales que plaquetas activadas contienen un número elevado de micropartículas, son los mejores utilizados para el tratamiento terapéutico de sangrado activamente pacientes39, mientras que los pacientes de Hematología-Oncología benefician no activado las plaquetas no o bajos niveles de micropartículas20. Recientemente se ha divulgado que en vitro la sensibilidad de las plaquetas del donante no impacto significativo en la recuperación y supervivencia de estas plaquetas en transfusiones solo a los pacientes estables, en su mayoría no destiñen hemato-oncología40 . De este hallazgo, se podría concluir que la activación plaquetaria por alto contenido de MP también no juega ningún papel importante en el tratamiento profiláctico de pacientes. Sin embargo, debido a la estrecha elección de pacientes, este estudio no abordó el impacto de factores donantes para complejo pacientes febriles (excluidos del estudio), no estable y recibir muchos más que sólo una transfusión de plaquetas. Cómo se puede reducir la complejidad de estos casos de pacientes – que sostiene la promesa de reducir la refractariedad – queda sin respuesta.

Micropartículas son marcadores tempranos de la inflamación41,42,43,44 y plaqueta activación45 y por lo tanto en muchos donantes normales. 19 en consecuencia, las plaquetas activadas y micropartículas están presentes en las donaciones de plaquetas. Es razonable la hipótesis de que los pacientes con fiebre, es decir, una completamente activado sistema inmune innato, no pueden tolerar el desafío adicional de una transfusión de plaquetas activadas. Sin embargo, se necesitan estudios para probar esta hipótesis. Proyección de micropartículas puede aliviar la incertidumbre actual sobre el contenido de las transfusiones de plaquetas y reducir la complejidad del tratamiento del paciente.

La proporción de plaquetas activadas a desactivado en un banco de sangre hospital depende principalmente en la población donante y en mucho menor medida en transporte, irradiación, inactivación de patógenos y otros procesos que pueden aumentar la activación plaquetaria en concentrados. 19 datos de bancos de sangre del hospital importante en los Estados Unidos mostraron que la composición promedio del inventario de plaquetas es 49% activado y desactivado el 51% (rango de plaquetas activadas: 38-62%, comunicaciones personales). Si los proveedores de productos de sangre o bancos de sangre del hospital quiere saber cuántos concentrados de plaquetas activados y no activados producen o reciben y gestionar su inventario basan en la activación plaquetaria como indicado por micropartículas de contenido, esto protocolo podría ser apropiado para ellos.

Basa en la composición de plaquetas un banco de sangre hospital será capaz de dirigir las plaquetas no activadas, homogéneas para profilaxis utilizaran y activan, plaquetas heterogéneas para uso terapéutico. Proyección de plaquetas permite que los hospitales maximizar el uso del inventario disponible que mejora la atención al paciente y disminuye el costo. Este protocolo está destinado a personal del laboratorio que están familiarizado con el manejo básico y manipulación de productos de la sangre.

Presentado aquí es un método de cribado de micropartículas en las transfusiones de plaquetas que pueden ser aplicadas sistemáticamente para gestionar el inventario de banco de sangre del hospital donde está deseable el producto basado en el contenido de micropartículas. El objetivo de este protocolo es describir la implementación y evaluación de DLS para detección de plaquetas donadas. El protocolo descrito aborda las preguntas comunes de acceso no invasivo a muestras, integración de la prueba en el Banco de sangre del flujo de trabajo y características de rendimiento.

Protocol

El siguiente protocolo se ha realizado en cumplimiento de todas las directrices de servicios de sangre canadienses (CBS). Voluntarios dieron consentimiento para que sus donaciones pueden ser utilizados para llevar a cabo estos estudios. Concentrados de plaquetas se prepararon según procedimientos operativos estándar CBS. Todas las pruebas de rendimiento descrita aquí se llevó a cabo en el centro para investigación de sangre en la Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá con aprobación de la Junta de ética de investigación institucional. 1. control de calidad Realizar una verificación de control de calidad por lo menos una vez por día para verificar el correcto funcionamiento del sistema DLS de la prueba. Medir las cuentas de control facilitado (radio de 50 nm) siguiendo las instrucciones del fabricante para su uso. Recuperar el frasco de control de almacenamiento en frío y permite 15 minutos a temperatura ambiente. Los granos deben equilibrar a temperatura ambiente antes de usar. Encienda el sistema DLS antes de preparar la muestra para que el láser de 15 min calentamiento período se completa con el tiempo que la primera muestra está lista para la prueba. Una vez que la consola ha puesto en marcha, siga las instrucciones en la pantalla para iniciar sesión y seleccione la opción sistema de prueba para medir la muestra de Control. Vórtice la mezcla el frasco para 10 s para una muestra representativa. Llenar un tubo capilar con las cuentas de control utilizando una pipeta de volumen fijo μl 100, pipeta y capilar desde el kit de prueba. Cuando se haya completado la prueba siga las instrucciones en la pantalla del sistema DLS.Nota: Los resultados del examen de cuentas de control se comparan automáticamente a la información almacenada en la etiqueta de código de barras control de grano y un pase o notificación de error muestra información como se muestra en la pantalla de sistema DLS al final de la prueba. 2. obtención de una muestra de un concentrado de plaquetas Nota: Estos pasos describen el proceso de muestreo no invasivo de la transfusión de plaquetas en la DLS prueba capilar para gestión de inventario de plaquetas rutinario. Un resumen se muestra en la figura 1. Requiere accesorios: tubo de sellador, separador de tubo manual, tijeras y protector de salpicaduras. Retire el concentrado de plaquetas de inventario. Obtener la muestra del producto de la plaqueta de una bolsa de muestreo sin usar (continúe con el paso 2.3) o un segmento de tubería (continúe con el paso 2.4 Si está vacío o paso 2.5 si no vacías).Para desconectar la bolsa de la tubería o segmento de la tubería Utilice un sellador de tubo. Para operar el sellador de tubo, siga las instrucciones del fabricante. Brevemente, la abrazadera del tubo que se sellará en una posición exacta entre dos mordazas calientes. En un dispositivo portátil, presione el tubo fundido juntos y enfriar bajo alta presión mientras presiona la palanca (se indica la duración de la luz verde) dando por resultado un sello permanente, prueba de fugas. Muestreo de una bolsa Mezclar el contenido de la bolsa de plaquetas bien suave movimiento horizontal de 5 s (vuelco de extremo a extremo cinco veces). Abra la pinza en la bolsa. La bolsa es evacuada y se llena por sí mismo. No es necesario llenar completamente la bolsa como a 100 μl de muestra será necesario para la prueba de DLS. Desconecte la bolsa de la bolsa por el tubo de calor sellado de la conexión con un sellador de tubo. Continúe con el paso 3. Muestreo de tubos de vacío Verificar que la bolsa de las plaquetas ha guardado tubería vacía y el bloque de la tubería es todavía en su lugar. Inspeccione visualmente la tubería para verificar que no hay una cantidad significativa de concentrado de plaquetas en la tubería. Si la tubería no está vacía continúe con el paso 2.5. Cierre el separador de tubo en la tubería como cerca del bloque de la tubería como sea posible por la compresión de las asas para exprimir el tubo entre los rodillos. Cuelgue la bolsa en posición vertical y mantener la compresión de las asas de stripper. Mientras que mantener el extractor cerrado, soltar el bloque de la tubería. Jale lentamente la stripper hacia abajo el tubo de vacío que permite el tubo llenar lentamente detrás de la stripper. Continuar hasta la sección debajo de la stripper ha inflado completamente o hasta que el stripper es dentro de 1 pulgada del extremo del tubo. Una vez que el punto se alcanza con la stripper, uso el sellador de tubo de calor sellar el tubo de 1 pulgada por encima de la stripper. Suelte los mangos de la stripper de tubo manual. Sellado caliente otra vez 1 a 2 pulgadas por encima de la anterior junta para crear el segmento de prueba. Cortar el segmento de prueba de la unidad de plaquetas. Este segmento se utilizará para la prueba de DLS. Muestreo de la tubería que no esté vacía Cuelgue la bolsa verticalmente y liberar el bloque de la tubería si en su lugar. Inspeccione visualmente la tubería para determinar si hay cualquier importantes macizos sólidos. Si existen grupos sólidos, sello por encima de ellos que no puede ser despojados en la bolsa. Cierre el separador de tubo en la tubería como cerca del extremo sellado del tubo como sea posible. Tira el contenido del tubo en la bolsa por la compresión de las asas para exprimir el tubo entre los rodillos y, manteniendo la fuerza de sujeción, hacia el separador de tubo a lo largo de la tubería de la bolsa. Retire la bolsa de plaquetas del gancho de colgar y mezclar suavemente la bolsa para 5 s por vuelco de extremo a extremo cinco veces mientras mantiene la stripper cerrado. Cuelgue la bolsa verticalmente manteniendo la stripper cerrada. Jale lentamente la stripper hacia abajo el tubo de vacío, lo que permite el tubo llenar lentamente detrás de la stripper. Continuar hasta la sección debajo de la stripper ha inflado completamente o hasta que el stripper es dentro de 1 pulgada del extremo del tubo. Una vez que el punto se alcanza con la stripper, uso el sellador de tubo de calor sellar el tubo de 1 pulgada por encima de la stripper. Comunicado de la stripper. Sellado caliente otra vez 1 a 2 pulgadas por encima de la anterior junta para crear el segmento de prueba. Corte y deseche la última porción de la tubería. Cortar el segmento de prueba de la unidad de plaquetas. Este segmento se utilizará para la prueba de DLS. 3. llenado de la muestra en la prueba capilar DLS Usando un protector de salpicaduras y tijeras limpias y secas, cortar un extremo de la bolsa de la tubería o segmento de la prueba.Nota: El tubo capilar utilizado para la prueba de DLS debe llenarse inmediatamente. Llenar el capilar mediante la herramienta de muestreo (pipeta de volumen fijo montado 100 μl, pipeta y tubo capilar) para extraer la muestra directamente de la bolsa abierta o segmento de la tubería en el capilar. Sellar la parte inferior del tubo de llenado capilar empujando suavemente el llenado capilar en el sellador de tubo capilar mientras aplica un toque suave y presión contra la bandeja. Desconecte el 100 μl fijo volumen pipeta y punta del tubo capilar, asegurando el capilar sigue siendo firmemente incrustado en el sellador de tubo capilar. Retire el capilar de la cubeta de sellador de tubo capilar, limpiar con una almohadilla de alcohol isopropílico y asegurar que no hay burbujas de aire son atrapadas por sacudiendo suavemente la parte inferior del tubo capilar. Coloque el capilar en el sistema DLS. 4. realizar la prueba DLS Seleccione la opción de la prueba de MP para iniciar una nueva prueba DLS para medir el contenido de micropartículas de una muestra de plaquetas. Introduzca la información de la muestra (número de identificación de donación (ISBT), producción de colección fecha de caducidad y código de producto) usando el escáner de código de barras o manual. Si no se dispone de ningún código de producto de que el sistema DLS puede extraer la información de medio líquida, seleccione manualmente el medio líquido apropiado (para plaquetas más concentrados seleccione plasma pero para muestras que contengan solución de aditivo de plaquetas (PAS), introduzca la porcentaje de plasma residual).Nota: Una pequeña desviación en el porcentaje PAS de la nominal 65% causará un error pequeño en la viscosidad (calculada automáticamente por el sistema DLS) que afecta mínimamente a la radio de MP calculado pero no % MP. Coloque el capilar en el sistema DLS cuando se le indique y comenzar la prueba. Una vez terminada la prueba, retire la muestra del soporte capilar y de los consumibles apropiadamente según las directrices de instalación. Retire la muestra del soporte capilar y de los consumibles apropiadamente según las directrices de instalación. Etiqueta de la bolsa de plaquetas con el color correspondiente al resultado, por ejemplo naranja para no activado (homogénea) con % MP igual o por debajo de 15% y rosa para activado (heterogénea) con % MP por encima del 15%. Figura 1 : Resumen método. Resumen de los pasos a realizar para la gestión de inventario de plaquetas rutina en un banco de sangre hospital: obtención de una muestra de una plaqueta concentrado, carga de la muestra en el capilar para la medición de DLS, realizar el DLS prueba para identificar micropartículas y el uso de la micropartícula divulgado contenido identificar plaquetas activadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Tiempo de preparación promedioLa plaqueta mediante un sistema DLS de proceso de selección se resume en la figura 1. Las plaquetas son probadas con el sistema DLS en el momento de recibo del proveedor de sangre. Como se detalla en la tabla 1 , el tiempo de preparación promedio de usuarios capacitados 2 min 23 s mientras la limpian y tiempos del post-test trabajo 14 s y 46 s, respectivamente. En total, el usuario promedio tiene 3 min y 23 s de tiempo de práctica por prueba. Actividad Tiempo activo Tiempo de prueba del Walk-away TOTAL Preparar sistema DLS 14 s Montar la herramienta de muestreo 28 s Obtener segmento 52 s Llene capilar y prueba 49 s 5 min Limpiar 14 s Inventario y etiqueta de bolsa de plaquetas 46 s Tiempo total necesario por muestra 3 min 23 s 5 min 8 min 23 s Tabla 1: desglose de tiempo prueba activa. La prueba sí mismo es un ensayo con una duración promedio de 5 minutos a pie. El usuario promedio tiene 3 min 23 s para preparar el sistema DLS para un examen, obtener una muestra siguiendo este protocolo y etiqueta de la bolsa de plaquetas. PrecisiónLa precisión del sistema DLS se evaluó en tres niveles de micropartículas, 0-7%, 12-25% y 28-75%. El rango clínicamente relevante de % MP es 3-75%. Dos operadores analizaron muestras control baja, media y alta durante 16 días de operación en sistemas de DLS en paralelo. Muestras se analizaron por duplicado, pero en orden aleatorio cada día prueba. La tabla 2 resume la precisión dentro del dispositivo de las medidas de la DLS para micropartículas de por ciento (% MP) con respecto a las plaquetas. Contenido de micropartículas Bajo Medio Alta Significa MP % (%) 4.4 19.5 53.8 Desviación estándar (%) 1.8 2.6 5.8 CV (%) 40.4 13.2 10.6 Tabla 2: precisión de dispositivo de micropartículas por ciento (% MP). En el contenido de micropartículas muy baja las plaquetas pequeñas pueden contribuir a % MP dando por resultado mayor variabilidad para las muestras de micropartículas bajo contenido. La tabla 3 muestra la precisión dentro del dispositivo de las medidas de DLS para micropartículas de medio radio entre 50-550 nm. Contenido de micropartículas Bajo Medio Alta Decir radio (nm) 331 161 188 Desviación estándar (mm) 133 41 25 CV (%) 40.1 25.2 13.5 Tabla 3: precisión de dispositivo de micropartículas radio. En micropartículas de muy bajo contenidas pequeñas plaquetas pueden contribuir a micropartículas por ciento (% MP) dando por resultado mayor variabilidad para las muestras de micropartículas bajo contenido. La tabla 4 muestra la reproducibilidad de las mediciones de la DLS para micropartículas de por ciento (% MP). Contenido de micropartículas Bajo Medio Alta Significa MP % (%) 4.4 29.2 53,6 Reproducibilidad (%) 1.5 2.3 5 CV (%) 35 11.8 9.4 Tabla 4: Reproducibilidad de las mediciones de la dispersión de luz dinámica (DLS) para micropartículas de por ciento (% MP). Linealidad deFigura 2 se muestra que los resultados DLS son lineales, es decir, forma una línea recta con respecto a los valores asignados de las muestras. Siete muestras fueron preparadas con diferentes contenido de micropartículas. Muestras con alta (MP7) y bajo contenido de micropartículas (MP1) y concentración de plaquetas que fueron preparadas y mezcladas en proporciones diferentes para crear muestras intermedias (MPx). Las muestras fueron analizadas con citometría de flujo como se describe anteriormente19 DLS y resultados de % MP cada concentración se trazaron como entrada y salida. El coeficiente de determinación resultó para ser 0.985. En la figura 3se muestran ejemplos de histogramas DLS para micropartículas bajo y alto contenido. Los resultados DLS fueron confirmados mediante citometría de flujo (figura 3B). Figura 2 : Comparación de citometría de flujo y los resultados DLS. Relación lineal entre % MP determinado por citometría de flujo (entrada) y DLS (salida), los datos originales de DLS de las dos muestras marcadas por la ○ símbolo abierto se muestran en la figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Contenido de micropartículas para diferenciar entre activadas y desactivado las plaquetas. (A) DLS resultados de contenido MP en plaquetas activadas (línea discontinua) fue de 57% frente al 4% en las plaquetas no activadas (línea sólida). Pruebas se realizaron a una temperatura de medición de 37 ° C, ajuste de viscosidad de plasma de 1,06 x10-3 Pa·s y ajustes de la intensidad total entre 200-600 kHz. (B) flujo cytometry resultados (como se describió anteriormente19) de las muestras de la misma como se muestra en (A); en los histogramas de dispersión hacia adelante P1 y P2 representan las puertas del MP y de la plaqueta, respectivamente; por plaquetas activadas (izquierdo) el 76% de los acontecimientos cayó en la puerta de MP en comparación con el 6% de plaquetas no activadas (derecha). La línea de regresión lineal sugiere una contribución relativa constante ruido de fondo % MP por citometría de flujo hacia los resultados consistentemente más altos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Especificidad/interferenciaLa organización internacional de normalización (ISO) define la especificidad analítica como la capacidad de un procedimiento de medición para detectar o medir únicamente el valor mientras que hay otras cantidades presentes en la muestra. La especificidad analítica de la investigación de micropartículas pueda verse afectada por glóbulos rojos (RBC). DLS mide contenido de MP en relación con el contenido de plaquetas. RBC puede interferir debido a la contribución de la dispersión de la RBC está incluida en la contribución de la dispersión de las plaquetas, reduciendo la contribución relativa de MP. Existen límites reglamentarios para el contenido permisible de RBC en productos de la sangre; una conversión conservadora del umbral recomendado por AABB concentración permisible de RBC en plaquetas concentrados-2 mL de lleno RBC en una unidad de plaquetas resultó en 8.0 x1010 células/L (supuestos: volumen de RBC es 8.5 x10-14L, hematocrito de RBC lleno es 68%, volumen de unidad de plaquetas es de 200 mL.) Las concentraciones de RBC residual reportadas en diversos productos están muy por debajo de este umbral46. Tres diferentes donantes donaron plaquetas y glóbulos rojos (RBC) en dos días diferentes, como elegibles, para los tres experimentos independientes. El contenido inicial de RBC en los concentrados de plaquetas (muestra de referencia) fue de 0.05 – 0.15 x109 células/L según lo determinado con un hemocitómetro. Cinco muestras adicionales fueron creadas por clavar en conocido cantidades de RBC en alícuotas del concentrado de plaquetas; niveles objetivo RBC en estas muestras fueron 1.0, 5.0, 10, 40 y 80 x109 células/L. El umbral de interferencia de glóbulos rojos era aproximadamente 1.0 x1010 células/L (figura 4), que también correlaciona con el nivel en que la presencia de glóbulos rojos era visualmente evidente (figura 5). Por encima de este nivel, fue subestimado % MP que quiere decir que en rojo las muestras que contienen visualmente RBC en lugar de micropartículas divulgado hemoglobina-el contenido será demasiado baja. Figura 4 : Relación lineal entre % MP (DLS) y concentración de glóbulos rojos (células/L). Aumento de las concentraciones de RBC de 0.1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010y 8.0 x1010 células/L (de izquierda a derecha) de 3 experimentos independientes (○ experimento 1 experimento ● 2, experimento □ 3, las líneas de regresión se muestran para cada experimento). Por encima de 1,0 x1010 RBC/L conduce a la subestimación de % MP. Aspecto visual de las muestras que contienen RBC se muestra en la figura 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Aspecto visual de eritrocitos que contienen las muestras. Enrojecimiento de la plaqueta las muestras que contienen concentraciones de RBC de 0.1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010y 8.0 x1010 células/L de izquierda a derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. PrecisiónExactitud se define como la diferencia entre el resultado de una sola medición y un valor verdadero de la cantidad asignada a la muestra. Este error de medición incluye un componente sistemático estimado por sesgo de medición y un aleatorio componente estimado de una desviación estándar. Por lo tanto, la precisión de un resultado de medición es una combinación de exactitud y precisión. Un cordón estándar fue utilizado para determinar la exactitud de la prueba DLS. Exactitud se evaluó en dos concentraciones dentro del rango clínicamente relevante del ensayo de MP 3-75%. Mezclas de grano de referencia se utilizan para preparar muestras de concentraciones conocidas porque referencia granos tienen un tamaño conocido y concentración. Por lo tanto, cuentas de referencia pueden ser mezclados para obtener las muestras con concentraciones y tamaños de partícula deseado. Granos del poliestireno estándar 125 radio nm se usaron para representar micropartículas y granos con 1,5 μm radio fueron utilizados para representar las plaquetas. Se evaluó la precisión del ensayo de micropartículas con mezclas de grano de aproximadamente 20% y 50% MP. La exactitud de los radios medidos partícula fue comparada con los radios de la partícula en los certificados de análisis para las cuentas de referencia como se muestra en la tabla 5. 125 granos de nm 1,5 μm Certificado de análisis Certificado de análisis MP 20% 50% MP MP 20% 50% MP Decir radio 122.0 113.8 124,4 1.5 1.6 1.60 STD Dev 4.5 2.83 3.6 0.035 0.06 0.07 CV 3.60% 2.48% 2,89% 2.20% 3.74% 4.05% Precisión 6.70% 2.00% 6.50% 6.30% Tabla 5: exactitud de las medidas de dispersión de luz dinámica (DLS). Comparación del tamaño de DLS resultados contra certificado de análisis de granos con 125 nm radio y radio 1,5 μm en mezclas.

Discussion

Este protocolo describe un método de dispersión de luz dinámica para la investigación de micropartículas optimizado para las concentraciones de partículas alto encontradas en muestras biológicas tales como concentrados de plaquetas. El método de DLS es inherentemente estandarizado para medir con precisión el tamaño. La relativa concentración de micropartículas se puede convertir en una absoluta concentración si se conoce la concentración de plaquetas y el área de pico de plaquetas se utiliza como el pico de referencia19. Como plaquetas concentraciones se obtienen generalmente con analizadores de la hematología o citómetros de flujo estos métodos pueden considerarse tecnologías de compañero a DLS.

La funcionalidad del sistema DLS está asegurada ejecutando el cuentas de control regularmente. Agua destilada puede medirse para comprobar que el ruido es mínimo. Estándares disponibles en el mercado de la plaqueta pueden ser analizadas como controles negativos de MP y, después de la adición de 125 granos de radio nm, como controles positivos de MP. Dentro de las concentraciones de gama biológica de MP de interés, los procedimientos son prácticas y rápidas para llevar a cabo como parte de la rutina de banco de sangre.

A diferencia de la citometría de flujo, este método no se basa en comparar las intensidades de la dispersión de las partículas sino más bien la velocidad de su movimiento browniano. Así, exosomas también pueden ser detectado a pesar de su pequeño tamaño y se informan por separado de MP.

Diseñado como una herramienta de detección, las limitaciones de este método están relacionadas con su incapacidad para distinguir entre diferentes tipos de micropartículas. Hay potencial margen de mejora si se utilizan medidas de aislamiento adicional; pueden ser muestras antes y después de la eliminación específica de micropartículas a través anticuerpo acoplado captura de grano magnético. Además, no puede suponerse que todos los detectados micropartículas son células derivado porque quilomicrones formados en hiperlipidemia47,48 y pequeñas bacterias o virus6 también se informará en la gama de micropartículas. Sin embargo, otras medidas de seguridad existen en el suministro de sangre para evitar altamente lipémicas o contaminadas las plaquetas para entrar en el inventario de bancos de sangre del hospital.

La elección del anticoagulante en la muestra afecta la magnitud de la activación plaquetaria y por lo tanto el contenido del MP49. Para las comparaciones de los diferentes productos, este factor debe ser considerado. Además, intercambio del plasma con los medios de suspensión libre de MP como PAS afectará el contenido del MP y el umbral para la determinación de heterogeneidad-si sólo un tercio del contenido original del MP quedo dentro del plasma residual en el concentrado un por consiguiente, menor umbral de contenido de MP indicará el mismo nivel de activación de las plaquetas en plasma de 100%. MP por ciento es el contenido del MP en relación a las plaquetas. Previamente se informó que el recuento de plaquetas promedio del producto PAS fue menor que el promedio del % MP todavía era 9,5%19. El umbral de % MP para plaquetas PAS con licencia en los Estados Unidos se encuentra actualmente al 10%.

Mientras que la principal fuente de MP en concentrados de plaquetas es el donante, procesos que causan estrés a las plaquetas aumentará el nivel de MP dependiendo de la susceptibilidad de las plaquetas al estrés-si las plaquetas son ya altamente activa, menores factores de estrés tales como larga vida de estante, inactivación de patógenos, lavado, irradiación o transporte interurbano podría conducir a un aumento significativo en el contenido de MP. Ninguno de estos estresores han demostrado para afectar significativamente homogénea, no activa las plaquetas19. Además, atención debe ser pagada a la posibilidad de cambios en la composición de la muestra dentro del tubo capilar si no probada inmediatamente después de la preparación (finalización del paso 3 del presente Protocolo).

Este protocolo trata de determinar la composición de las partículas presentes en las transfusiones de plaquetas y utilizar micropartículas como biomarcadores de activación plaquetaria. Las transfusiones de plaquetas están etiquetadas como sea desactivado (naranja) o activa (rosa) basada en un umbral de porcentaje de micropartículas del 15%. El umbral del 15%, que MP para plaquetas en plasma de 100% fue determinada empíricamente comoel percentil promedio 66 desde múltiples sitios .

El objetivo de la gestión de inventario de plaquetas basado en micropartículas de rutina de detección con DLS es mejorar las eficiencias de costo cuidado y unidad de paciente por prevenir la refractariedad plaquetaria no inmunológica. La implementación del sistema para la detección de bolsas de plaquetas DLS permitirá al usuario dirigir las plaquetas no activadas a poblaciones de pacientes más en riesgo de desarrollar la refractariedad plaquetaria.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los donantes de sangre y al personal en centro de red de servicios de sangre canadiense desarrollo aplicado para la recolección y producción de las unidades de plaquetas utilizadas en este estudio. Reconocemos la Fundación de Canadá para la innovación y la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud para la financiación de infraestructura en el centro de UBC para la investigación de la sangre. Financiamiento para la publicación fue proporcionado por LightIntegra Technology Inc., fabricante de ThromboLUX.

Materials

ThromboLUX-M LightIntegra Technology Inc.  LPN120 DLS System
ThromboSight Software LightIntegra Technology Inc.  LPN124 DLS analysis software
Capillaries LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) LPN065 Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) LPN082 100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) LPN080 Pipette tips for sampling
Critoseal  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) LPN075 Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) LPN085 Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) LPN128 Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm PolySciences Inc. 64060 Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm PolySciences Inc. 64014-15 Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent Genesis BPS 428-SE640 Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent Fresenius Kabi 6R4452 Manual tube stripper
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent CardinalHealth S1389-75 Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent Corning Incorporated 6775 Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent BD Biosciences 338960 Flow cytometer
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Platelet TransfusionsMicroparticle ContentPlatelet ActivationRoutine Screening MethodDynamic Light ScatteringPlatelet Concentrate SamplingTube StripperTubing Segment Sampling

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Millar, D., Murphy, L., Labrie, A., Maurer-Spurej, E. Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions. J. Vis. Exp. (131), e56893, doi:10.3791/56893 (2018).
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