Gestione del magazzino della piastrina basato su contenuti di microparticelle in concentrati piastrinici di screening è una nuova iniziativa di miglioramento di qualità in banche del sangue. L’obiettivo è quello di differenziare attivato dalle piastrine non attivato per ottimizzare l’uso delle piastrine. Fornendo le piastrine non attivato ai pazienti di Ematologia-Oncologia potrebbe ridurre il loro rischio alto per diventare refrattario.
Gestione del magazzino della piastrina basato su contenuti di microparticelle in concentrati piastrinici di screening è una nuova iniziativa di miglioramento di qualità per banche del sangue. Frammento di cellule fuori microparticelle (MP) quando sono stressati. Sangue e i suoi componenti possono contenere frammenti cellulari da una varietà di cellule, in particolare da piastrine attivate. Quando si eseguono loro ruoli come cellule dell’immunità innata e principali attori in coagulazione e del hemostasis, piastrine cambiano forma e generano microparticelle. Con diffusione dinamica della luce (DLS)-base di rilevamento microparticella, è possibile differenziare attivato (alta microparticella) dalle piastrine non attivato (basso microparticella) nelle trasfusioni e ottimizzare l’uso di questo prodotto di sangue scarso. Ricerca precedente suggerisce che fornendo le piastrine non attivato per uso profilattico in pazienti di Ematologia-Oncologia potrebbe ridurre il loro rischio di diventare refrattario e migliorare la cura del paziente. L’obiettivo di questo metodo di screening è ordinariamente differenziare attivato dalle piastrine non attivato. Il metodo qui descritto viene descritta la procedura da eseguire per la gestione dell’inventario sistematico delle piastrine in una banca del sangue: ottenendo un campione da una trasfusione di piastrine, caricamento del campione nel capillare per la misurazione di DLS, eseguendo il DLS prova a identificare le microparticelle e utilizzando il contenuto segnalato microparticelle per identificare le piastrine attivate.
L’interesse in microparticelle ha ruotava principalmente intorno a loro coinvolgimento nei processi di comunicazione e biologico-cellula delle cellule. 1 , 2 , 3 più di recente, microparticelle hanno anche attirato interesse come potenziale marker precoce di diagnostica delle malattie autoimmuni e cardiovascolari. 4 , 5 microparticelle, noto anche come extracellulare vescicole o esosomi, ampiamente sono state studiate mediante citometria a flusso. Purtroppo, nonostante gli sforzi per standardizzare i protocolli di cytometry di flusso convenzionale non ci è consenso sul protocollo ottimo da utilizzare. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Anche se la citometria a flusso convenzionale può caratterizzare specifiche sottopopolazioni di MP,11 ha molte segnalato limitazioni. 11 , 12 , 13 , 14 alcune di queste limitazioni sono stati risolti utilizzando laser di potenza superiore e rivelatori di un cosiddetto “opzione di piccole particelle”,15,16 , nonché rilevamento in avanti di 15 ° – 25 ° angolo di dispersione e modificato guaina pressione . 17 , 18 tuttavia, un metodo di screening rapido e facile da usare che può essere combinato con questi metodi sofisticati è ancora necessario utilizzare microparticelle come marcatori diagnostici precoci. I livelli elevati di microparticelle sono rilevabili in circa un terzo dei donatori di sangue normale19 e potrebbero indicare condizioni infracliniche. Di conseguenza, microparticella alti livelli nei prodotti di donazioni di sangue potrebbero essere incompatibili con i destinatari vulnerabili. 20
Quando si forniscono le trasfusioni della piastrina, c’è un rischio di refrattarietà non immune – una condizione in cui il corpo di un paziente rifiuta le trasfusioni consecutive e non consente una porzione significativa delle piastrine a circolare. 21 , 22 refrattarietà Non-immune può causare le trasfusioni sprecate, complicazioni di salute per i pazienti e ospedale estesi soggiorni. 23 le trasfusioni della piastrina contenente un numero elevato di microparticelle possono essere un fattore di contributo per lo sviluppo della refrattarietà non immune in pazienti vulnerabili di Ematologia-Oncologia. 20 è possibile gestire l’inventario delle piastrine secondo la composizione di trasfusioni piastriniche di screening per microparticelle riducendo quindi il rischio per i pazienti vulnerabili. Tuttavia, la maggior parte microparticella test richiedono l’isolamento delle microparticelle da piastrine5,12 o sono altrimenti molto labor intensive24,25 e pertanto non può essere attuato regolarmente in ospedale banche del sangue.
La tecnica descritta qui usa la dispersione della luce dinamica (DLS) – noto anche come spettroscopia a correlazione di fotoni o diffusione quasi elastica della luce. Per decenni, dispersione della luce dinamica è stato ampiamente utilizzato nell’industria farmaceutica per caratterizzare formulazioni liposomiali farmaci o emulsioni dove le dimensioni delle particelle sono nella gamma sub-micron. 26 , 27 tuttavia, strumenti sviluppati per queste applicazioni non sono ottimizzati per emoderivati di schermo. Un nuovo sistema di liste di distribuzione è stato sviluppato per superare i limiti tecnici e rendere la diffusione dinamica della luce utile per lo screening di trasfusioni piastriniche. 28
Dispersione della luce dinamica misurazioni eseguite illuminando le particelle in sospensione con luce laser e analizzando la variazione di tempo dell’intensità luminosa sparsi che è una conseguenza delle particelle in sospensione in movimento. Inoltre, questo metodo utilizza la relazione inversa tra la velocità della particella e dimensione – piccole particelle si muovono velocemente e grandi particelle si muovono lentamente – per fornire informazioni sulle distribuzioni per ampiezza e relative concentrazioni dei componenti del campione. Utilizzando DLS, le microparticelle di medio raggio di contenuti e medio del componente microparticella può essere quantificato. Il contenuto delle microparticelle nell’emocomponente è dato % MP sulla base della superficie nell’istogramma misurato per raggi di particelle da 50-550 nm. Mentre le particelle con raggi inferiori a 50 nm sono rilevati dal DLS e segnalati dal sistema di liste di distribuzione, non sono inclusi in % MP. Piuttosto che isolare microparticelle dalle piastrine, l’eterogeneità delle trasfusioni della piastrina è determinato sulla base del relativo contenuto in un campione di microparticelle e piastrine. Infatti, il rapporto tra le cime della piastrina e microparticelle può essere utilizzato per calcolare la concentrazione assoluta di MP quando il conteggio delle piastrine è noto. 19
Il sistema di liste di distribuzione fornisce operatori sanitari con informazioni qualitative e quantitative su microparticelle trovate negli esemplari derivati da sangue o emoderivati. Il vantaggio principale della tecnica DLS descritto sopra tecniche alternative quali la citometria a flusso, microscopia elettronica,29 nanoparticle tracking analysis30 o impulso resistivo sintonizzabile31 di rilevamento è la preparazione del campione: le aliquote di concentrati piastrinici possono essere misurate direttamente senza la necessità di isolare MP da piastrine, diluizione del campione o altre modifiche. 9 , 17 inoltre, DLS è un metodo di ridimensionamento assoluto e non soffre la mancanza di perle di calibrazione con indice di rifrazione appropriato. 14 , 32
Una correlazione tra l’attivazione della piastrina e MP contenuto precedentemente è stata indicata da microscopia33,20 e possa essere dedotte dall’aumento nel contenuto di MP in condizioni patologiche15,34, 35 , 36 e in condizioni in vitro conosciute per attivare le piastrine. 19 , 37 , 38 tuttavia, ulteriori studi sono necessari per comprendere appieno il rapporto di attivazione della piastrina e contenuto microparticella DLS-misurato. Basate sulla nostra conoscenza attuale che le piastrine attivate contengono un numero elevato di microparticelle, essi sono i migliori utilizzati per il trattamento terapeutico di spurgo attivamente pazienti39, mentre Ematologia-Oncologia pazienti beneficiano non attivato piastrine con no o bassi livelli di microparticelle20. Recentemente è stato segnalato che in vitro la reattività delle piastrine del donatore non ha impatto significativamente il recupero e la sopravvivenza di queste piastrine nel singole trasfusioni per pazienti stabili, per lo più non-spurgo di Ematologia-Oncologia40 . Da questa constatazione, si potrebbe concludere che l’attivazione della piastrina identificato dall’alto contenuto di MP inoltre non svolge nessun ruolo significativo nel trattamento profilattico di pazienti. Tuttavia, a causa della stretta selezione dei pazienti, questo studio non ha affrontato l’impatto dei fattori di donatore per pazienti complessi che sono febbrili (esclusi dallo studio), non stabile e ricevere molti più di una trasfusione di piastrine. La questione di come è possibile ridurre la complessità di questi casi di pazienti – che mantiene la promessa di ridurre la refrattarietà – rimane senza risposta.
Microparticelle sono marker precoce di infiammazione41,42,43,della piastrina e44 attivazione45 e pertanto vengono rilevate in molti donatori sani. 19 di conseguenza, le piastrine attivate e microparticelle sono presenti nelle donazioni della piastrina. È ragionevole ipotizzare che i pazienti con febbre, vale a dire, un completamente attivato sistema immunitario innato, non possono tollerare la sfida aggiuntiva di una trasfusione di piastrine attivate. Tuttavia, gli studi sono necessari per provare questa ipotesi. Lo screening microparticella può alleviare l’attuale incertezza circa il contenuto di trasfusioni piastriniche e ridurre la complessità del trattamento del paziente.
Il rapporto delle piastrine attivate per non attivato in una banca del sangue dipende principalmente sulla popolazione dei donatori e in misura molto minore per i trasporti, irradiazione, inattivazione dell’agente patogeno e altri processi che potrebbero aumentare l’attivazione piastrinica in concentrati. 19 dati dalle principali banche del sangue negli Stati Uniti ha mostrato che la composizione media dell’inventario della piastrina è attivato di 49% e 51% non attivato (fascia per piastrine attivate: 38-62%, comunicazioni personali). Se i fornitori di prodotti del sangue o banche del sangue vuole sapere quanti concentrati della piastrina attivati e non attivati producono o ricevere e desidera gestire il proprio inventario basato sull’attivazione piastrinica come indicato da microparticelle di contenuto, questo protocollo potrebbe essere appropriato per loro.
Basato sulla composizione della piastrina una banca del sangue sarà in grado di indirizzare le piastrine non attivato, omogenee per profilassi e attivata, piastrine eterogenee per uso terapeutico. Lo screening della piastrina permette agli ospedali di massimizzare l’utilizzo dell’inventario disponibile che migliora la cura del paziente e riduce il costo. Questo protocollo è destinato per il personale di laboratorio che hanno familiarità con la gestione di base e la manipolazione di prodotti del sangue.
Presentato qui è un metodo di screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina che possono applicarsi ordinariamente per gestire l’inventario di banca del sangue di ospedale dove selezionando prodotto basato sul contenuto di microparticelle è auspicabile. L’obiettivo del presente protocollo è quello di delineare l’attuazione e la valutazione delle liste di distribuzione per lo screening delle piastrine donate. Il protocollo descritto riguarda le domande comuni di accesso non invasivo ai campioni, integrazione del test nel flusso di lavoro di banca del sangue e caratteristiche prestazionali.
Questo protocollo descrive un metodo di diffusione dinamica della luce per lo screening di microparticelle ottimizzato per la concentrazione di particelle ad alta che si trovano in campioni biologici come i concentrati della piastrina. Il metodo di DLS è intrinsecamente standardizzato per misurare con precisione la dimensione. La concentrazione relativa di microparticelle può essere convertita in una concentrazione assoluta, se la concentrazione di piastrine è nota e l’area del picco della piastrina è usato come il picco di riferimento19. Come piastrina concentrazioni sono ottenute solitamente con analizzatori ematologici o citometri a flusso questi metodi possono essere considerati tecnologie compagno a liste di distribuzione.
La funzionalità del sistema DLS è assicurata mediante l’esecuzione di microsfere di controllo regolarmente. Acqua distillata può essere misurato per verificare che il rumore di fondo è minimo. Gli standard disponibili nel commercio della piastrina possono essere analizzati come comandi MP-negativi e, dopo l’aggiunta di perline di raggio 125 nm, come controlli di MP-positivi. All’interno le concentrazioni di gamma biologica di MP di interesse, le procedure sono pratico e veloce da eseguire come parte della banca del sangue di routine.
Al contrario di citometria a flusso, questo metodo non si basa sul confronto tra le intensità di dispersione delle particelle, ma piuttosto la velocità del loro moto browniano. Così, gli esosomi possono essere individuati anche nonostante le loro piccole dimensioni e sono riportati separatamente da MP.
Concepito come uno strumento di screening, le limitazioni di questo metodo sono legate alla sua incapacità di distinguere tra diversi tipi di microparticelle. Non c’è margine potenziale di miglioramento se vengono utilizzate fasi di isolamento aggiuntivo. i campioni potrebbero essere testati prima e dopo la rimozione specifica di microparticelle attraverso anticorpo accoppiato cattura di biglie magnetiche. Inoltre, non si può presumere che tutti rilevati microparticelle sono cellule derivate perché chilomicroni formati in iperlipidemia47,48 e piccoli batteri o virus6 verranno segnalati anche nella gamma microparticella. Tuttavia, altre garanzie esistono all’interno il rifornimento di sangue per evitare altamente lipemici o contaminati le piastrine per immettere l’inventario di banca del sangue di ospedale.
La scelta di anticoagulante nel campione incide sull’estensione dell’attivazione piastrinica e quindi il contenuto di MP49. Per i confronti di prodotti diversi questo fattore deve essere considerato. Inoltre, scambio di plasma con supporti sospensione libera MP come PAS influenzerà il contenuto di MP e la soglia per la determinazione di eterogeneità-se solo circa un terzo del contenuto MP originale viene lasciato all’interno del plasma residuo nel concentrato un MP contenuto soglia indicherà lo stesso livello di attivazione della piastrina come 100% del plasma di conseguenza inferiore. Percentuale MP è il tenore di MP rispetto le piastrine. Precedentemente è stato segnalato che il conteggio delle piastrine medio del prodotto PAS era inferiore in modo che il medio % MP era ancora 9,5%19. La soglia di % MP per le piastrine PAS in licenza negli Stati Uniti è attualmente impostata al 10%.
Mentre la fonte primaria di MP in concentrati piastrinici è il donatore, i processi che causano stress alle piastrine aumenterà il livello di MP a seconda della suscettibilità delle piastrine a sottolineare-se le piastrine sono attivate già altamente, minori fattori di stress come Extended shelf life, inattivazione dell’agente patogeno, lavatrice, irradiazione o trasporto su lunga distanza potrebbe portare ad aumento significativo nel contenuto di MP. Nessuno di questi fattori di stress sono stati indicati per incidere in maniera omogenea, non attivata piastrine19. Inoltre, l’attenzione dovrebbe essere pagato al potenziale per i cambiamenti nella composizione del campione all’interno del capillare se non testato immediatamente dopo la preparazione (completamento del punto 3 del presente protocollo).
Il fuoco di questo protocollo è il determinare la composizione delle particelle presenti in trasfusioni della piastrina e di utilizzare microparticelle come biomarcatori dell’attivazione della piastrina. Le trasfusioni di piastrine sono contrassegnate come non attivato (arancio) o attivate (rosa) basato su una soglia percentuale di microparticelle del 15%. La soglia del 15% MP per le piastrine nel plasma di 100% è stato determinato empiricamente come il percentile dith media 66 da più siti.
L’obiettivo della gestione dell’inventario della piastrina basato su routine microparticella di screening con DLS è di migliorare l’efficienza di costo cura e unità paziente impedendo la refrattarietà della piastrina non immune. L’implementazione del sistema per lo screening dei sacchetti della piastrina DLS consentirà all’utente di indirizzare le piastrine non attivato per popolazioni di pazienti più a rischio per lo sviluppo di refrattarietà della piastrina.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i donatori di sangue e il personale Canadian Blood Services Network Centre per sviluppo applicato per raccolta e di produzione delle unità della piastrina utilizzata in questo studio. Riconosciamo la Fondazione canadese per l’innovazione e la Fondazione di Michael Smith per ricerca di salute per il finanziamento delle infrastrutture presso il centro di UBC per la ricerca di sangue. Finanziamenti per la pubblicazione è stato fornito da LightIntegra Technology Inc., produttore di ThromboLUX.
ThromboLUX-M | LightIntegra Technology Inc. | LPN120 | DLS System |
ThromboSight Software | LightIntegra Technology Inc. | LPN124 | DLS analysis software |
Capillaries | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) | LPN065 | Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated |
MiniPet | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) | LPN082 | 100 µL fixed volume pipette for sampling |
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) | LPN080 | Pipette tips for sampling |
Critoseal | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) | LPN075 | Capillary Tube Sealant |
Dukal Alcohol Pad or equivalent | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) | LPN085 | Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol) |
Control beads, 50 nm radius | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) | LPN128 | Control beads |
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm | PolySciences Inc. | 64060 | Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm | PolySciences Inc. | 64014-15 | Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent | Genesis BPS | 428-SE640 | Tube sealer |
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent | Fresenius Kabi | 6R4452 | Manual tube stripper |
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent | CardinalHealth | S1389-75 | Splash Shield |
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent | Corning Incorporated | 6775 | Vortex mixer |
FACSCanto II Flow cytometer with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent | BD Biosciences | 338960 | Flow cytometer |