Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue
Summary
Ce protocole décrit comment utiliser une in vitro isolé tortue préparation tête pour mesurer la cinématique des mouvements de leurs yeux. Après l’ablation du cerveau de la boîte crânienne, nerfs crâniens peut être stimulées par des courants de quantifier les rotations de le œil et les changements dans la taille de la pupille.
Abstract
Après que les animaux est euthanasiés, leurs tissus commencent à mourir. Tortues d’offrir un avantage en raison d’une plus longue durée de survie de leurs tissus, surtout comparé aux vertébrés à sang chaud. Pour cette raison, des expériences in vitro chez les tortues peuvent être effectuées pour des périodes prolongées de temps pour étudier les signaux neurones et le contrôle de leurs actions de la cible. En utilisant une préparation de tête isolée, nous avons mesuré la cinématique des mouvements oculaires chez les tortues, et leur modulation par des signaux électriques portés par les nerfs crâniens. Après que le cerveau a été supprimé sur le crâne, laissant les nerfs crâniens intact, la tête disséquée a été placée dans un cardan pour calibrer les mouvements des yeux. Électrodes de verre étaient attachés aux nerfs crâniens (oculomoteur, trochléen et abducens) et stimulés par des courants d’évoquer les mouvements des yeux. Nous avons suivi les mouvements des yeux avec une vidéo infrarouge suivi système et quantifiées rotations des yeux. Les impulsions de courant avec une gamme des amplitudes, des fréquences, et durées de train ont été utilisées pour observer les effets sur les réponses. Parce que la préparation est séparée par le cerveau, la voie efférente va cibles musculaires peut être examinée isolément pour étudier la signalisation neuronale en l’absence d’informations sensorielles centralement traitées.
Introduction
Justification de l’utilisation des tortues à oreilles rouges dans des expériences électrophysiologiques :
Tortues à oreilles rouges (Trachemys scripta elegans), sont considérés comme un des pires d’espèces envahissantes du monde1 et peut indiquer qu’un écosystème est en difficulté. Pourquoi les tortues à oreilles rouges sont parvenus est mal comprise, mais elle peut être en partie en raison de leur physiologie tolérante et la possession des tissus nerveux qui peut survivre dans des conditions hypoxiques2,3,4 . Leur utilisation pour l’expérimentation ne menace pas leurs numéros et avec des efforts minimes, préparations électrophysiologiques peuvent demeurer viables sur longues durées, tant que 18 heures5,6. L’avantage est semblable à l’avantage d’utiliser des animaux invertébrés tels que les écrevisses7, qui ont également la capacité de résister à faibles niveaux d’oxygène8.
Techniques de mesure des mouvements oculaires :
Approches pour mesurer les mouvements des yeux chez les animaux aux yeux frontal à l’aide de primates non humains ont été bien développé9. Le œil tourne en orbite autour de trois axes : horizontal, vertical et de torsion. La méthode de bobine magnétique de recherche est généralement considérée comme la plus fiable pour la mesure des rotations, mais est envahissante, exigeant des petites bobines pour être inséré dans les scleras des animaux10,11. Systèmes vidéo peuvent également mesurer des rotations et ont l’avantage d’être non invasive. Le développement de meilleures caméras ainsi que de traitement d’image innovants ont amélioré leurs fonctionnalités rendant les systèmes axés sur la vidéo une alternative intéressante à envisager le12,13,14.
Les techniques développées pour mesurer les mouvements des yeux en nonmammals ont été beaucoup moins importants. Mesures sont soit basse résolution ou décrivent quelques-unes des rotations15,16,17,18. Le manque de développement peut être partiellement attribué à la difficulté de nonmammals de formation pour suivre des cibles visuelles. Bien que les mouvements oculaires ont été bien documentés dans les oreilles rouges tortues19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, en raison de la contestation chez les animaux de la formation de suivre les objectifs, la cinématique précise de leurs mouvements oculaires est mal compris.
Tortues à oreilles rouges sont généralement considérés comme vertébrés aux yeux latéraux, mais parce qu’ils peuvent rentrer complètement leurs têtes dans leur coquille31, occlusion significative des champs visual latéraux de la carapace produit32. Le résultat est que leur ligne de mire visuelle est forcé vers l’avant, ce qui les rend se comportent plus comme des mammifères aux yeux frontal. Par conséquent, leur utilisation comme un modèle pour l’élaboration d’approches pour mesurer les mouvements des yeux offre également un point de vue évolutif unique.
Le protocole décrit dans cet ouvrage utilise une préparation in vitro isolés tête pour identifier la cinématique des mouvements oculaires dans les tortues à oreilles rouges. Cerveau est disséqués de crânes laissant les nerfs crâniens intact. Chefs sont placées dans un cardan pour calibrer les mouvements oculaires et évoquent des réponses par stimulation électrique des nerfs crâniens innervant les muscles oculaires. Des rotations par les yeux, les mesures sont faites par un système vidéo, en utilisant des algorithmes logiciels, qui trace la pupille sombre et les marquages de l’iris. L’établissement offre la possibilité de mesurer la cinématique des deux extra-oculaires (c’est-à-direles rotations horizontales, verticales et torsion)32 et intraoculaires (c.-à-d., variations de la pupille)33 mouvements.
Système de modèle pour l’analyse des voies nerveuses efférentes :
Plus généralement, l’approche offre la possibilité d’étudier les signaux neuronaux efférents comment générer des mouvements oculaires lorsque les muscles commencent leurs États détendue et en l’absence d’information sensorielle intégré traitée par le cerveau32, les enquêteurs 33. Par conséquent, la cinématique de le œil peut être examinée dans un système de modèle dans lequel elles sont traitées uniquement par la voie neuronale efférente, laissant le cerveau et synapsing sur les muscles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes essentielles :
Les étapes critiques au sein de ce protocole sont les suivants : 1) la dissection et le soin apporté à maintenir la viabilité des nerfs sectionnées ; 2) la correspondance des tailles par les électrodes d’aspiration aux nerfs crâniens à répondre de manière cohérente ; et 3) le placement de la tête dans le cardan d’étalonnage adéquat des rotations de le œil.
Dépannage :
La dissection peut être diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Paulette McKenna et Lisa Pezzino dans cette étude pour les services de secrétariat et M. Phil Auerbach pour le support technique. Les auteurs remercient également les Drs Michael Ariel et Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) pour nous introduire à la préparation de tête en vitro isolé. Prise en charge de cette collaboration a été financé par le département de biologie (Robert S. Chase Fund), le Comité de la recherche universitaire et du programme de neurosciences au Lafayette College. Enfin, cette oeuvre est dédiée à M. Phil Auerbach, qui est décédé le 28 septembre 2016 ; Il a retiré du service en microscopie électronique à balayage et a reconnu l’utilité de son étape 5 axes pour une utilisation dans le présent protocole. Son amitié et l’ingéniosité nous manquera grandement.
Materials
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
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