דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים
Summary
העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.
Abstract
הפונקציה העיקרית של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך שומר על מחסום מכני אל העולם החיצון. בנוסף, keratinocytes ממלאות תפקיד חיוני החניכה, תחזוקה, רגולציה של תגובות חיסוניות עוריות באופן אקטיבי של מערכת החיסון המולדת להגיב לגירויים antigenic בצורה מהירה, לא ספציפית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור בידוד של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, ומדגימים כי תאים אלה מגיבים סידן-induced התמיינות סופנית, כפי שנמדדה על ידי ביטוי מוגבר של involucrin סמן בידול. בנוסף, אנו מראים כי keratinocytes מבודדים הם מגיבים IL-1β-induced הפעלת איתות המסלולים תאיים כפי שנמדד על-ידי הפעלת מסלול MAPK p38. יחדיו, נתאר שיטת בידוד, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. מאחר keratinocytes הן סוג התא השולט האפידרמיס, שיטה זו שימושית לחקור את המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית בתוך חוץ גופית.
Introduction
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם ומשמש מחסום מגן מפני הסביבה החיצונית. העור מורכב שתי שכבות עיקריות: דרמיס לאפידרמיס, איפה האפידרמיס מהווה את השכבה החיצונית ביותר של העור. הסוג הנפוץ ביותר תאי האפידרמיס הוא keratinocytes הכוללת יותר מ 95% של מסה1,תא2. Keratinocytes נשמרים בשלבים שונים של בידול האפידרמיס, מאורגנים לשכבות הבזליים, spinous, פרטנית ו cornified התואמים בשלבים מסוימים של בידול3. התפקיד העיקרי של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך לייצר מחסום שלם לעולם החיצון.
Keratinocytes לייצג גם את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בעור, לכן יש תפקיד חשוב ב4,תגובה חיסונית מולדת5. חשיפת keratinocytes לגירויים חיצוניים מוביל ההפעלה של איתות המסלולים תאיים ובעקבות כך, ייצור של מספר מתווכים דלקתיים שונים, לרבות ציטוקינים, נוגדנים פפטידים מיקרוביאלית. חלבונים אלה נגזר תקין להשתתף בתגובה דלקתית על ידי גיוס והפעלת תאים חיסוניים כגון תאים דנדריטים, נויטרופילים ספציפי T תאים6,7. לכן, בגלל keratinocytes לשחק תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים רבים, הרציונל מאחורי הטכניקה המובאת כאן היה ליצור מודל במבחנה ללמוד ביולוגיה העור. תרבויות תקין ראשוני המתקבל העורלה neonatal משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד העור-ביולוגיה-8,–9. עם זאת, עם הטכניקה המתוארת כאן, keratinocytes של שני המינים מתקבלים וכתוצאה מכך מגוון ביולוגי גבוה יותר של התאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על בידוד ועל הדור של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, כולל תחזוקה, הקפאה של keratinocytes. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ראשי keratinocytes אנושי שיכול לשמש כמודל ללמוד ביולוגיה עורית חוץ גופית בתוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו נתאר כיצד לבודד בקלות keratinocytes האדם העיקרי מן העור למבוגרים, וכיצד תרבות אותם במבחנה. מודל זה יכול להיות יישום נרחב לחקירה של ביולוגיה של התא עוריות ולאחר יכול להיות שימושי עבור מהחוקרים המעוניינים ללמוד מחלות עורית.
חלק מהיתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא בנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות אנט Blak רסמוסן, קריסטין מולר התמיכה הטכנית שלהם
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
