Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma
Summary
Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell’abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l’identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l’efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l’accurata analisi della traduzione in vivo .
Introduction
traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell’espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L’obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l’occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.
Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.
Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up – o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l’efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l’analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l’isolamento delle orme protet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
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