Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol
Summary
Çevresel organoklorin pestisitlerinin (OKP) hepatositlerde mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisinin anlaşılması metabolik bozukluklara neden olan OKP’lerin mekanizmasının araştırılmasında önemlidir. Bu yazıda hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması nda ayrıntılı yöntemler yer alıyor.
Abstract
Bu yazı, hepatositlerde çevresel organoklorin pestisitlerinin (OCP) neden olduğu metabolik bozuklukların nedenini daha iyi anlamak için hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır. HepG2 hücreleri β-heksaklorosiklohekza (β-HCH) 24 saat boyunca genel popülasyonda eşdeğer bir iç maruziyet dozuyla maruz kaldı. Hepatositlerde ultrayapı iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından incelendi ve mitokondrinin hasarını gösterdi. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5′-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mitokondriyal yeşil floresan sonda ile lekelendikten sonra mitokondri floresan yoğunluğu floresan mikroskopi ile gözlendi. ATP düzeylerini belirlemek için luciferin-luciferase reaksiyonu kullanıldı. MMP katyonik boya JC-1 tarafından tespit edildi ve akış sitometrisi altında analiz edildi. OCR hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü. Özetle, bu protokoller hepatositlerde mitokondriyal fonksiyonun saptanmasında ve mitokondri hasarlarının araştırılmasında kullanılmıştır.
Introduction
Organoklorin pestisitlerinin (OKS) sağlık üzerindeki etkileri, örneğin üreme paraziti, immünolojik toksisite, metabolik değişiklikler daha önce incelenmiştir1,2,3. Hücresel metabolizmayı saptamak ve mitokondriyal disfonksiyon bulmak için yöntemler bilim adamları mitokondriyal fonksiyonun rolünü anlamak için etkin(yani., mitokondriyal STAT3 düzeyleri, laktat, pirüvat, laktat-pirüvat oranı, koenzim Q10, mitokondriyal proton sızıntısı, biyoenerjit, biyogenez ve dinamikler) yaşlanma gibi alanlarda, obezite, diyabet, kardiyovasküler fonksiyon, kanser, ve güvenlik toksisitesi4,5,6,7. Bu yazıda OKP’lerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyonudeğerlendirme yöntemleri ni açıklanmıştır.
HepG2 hücrelerini, insan iç maruziyetine eşdeğer bir dozda 24 saat boyunca, bir temsilci OKP olan β-heksaklorosikloheksan (β-HCH) maruz bıraktık. Öncelikle, TEM nükleus, mitokondri ve endoplazmik retikulum 8 gibi hepatositlerin8ultrayapısını gözlemlemek için uygulanmıştır. Tem, sıradan mikroskoplarla karşılaştırıldığında, hücre ve hücre bileşenlerinin (hücre hatları veya doku), morfolojisi, kimyasal bileşimi ve modern bilim ve teknolojide önemli bir rol oynayan doğal veya yapay malzemelerin işlevinin 2D ve 3Boyutlu ultra yapısını keşfetmeyi mümkün kılmıştır. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon daha fazla mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5′-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mito-tracker yeşil canlı hücre mitokondri-spesifik floresan boyama için kullanılabilecek bir mitokondri yeşil floresan sonda. Hepatositlerde mitokondri mito-izci yeşil çözeltisi ile boyandı ve mitokondriyal floresan yoğunluğu, sayısı ve paterni konfokal mikroskopi ile gözlendi9. Mitokondriyal yeşil floresan sonda canlı hücreleri lekelemek için kullanılabilir. Rhodamine 123 veya JC-1 ile karşılaştırıldığında, mitokondriyal yeşil floresan prob mitokondriyal boyama için mitokondriyal membran potansiyeline bağlı değildir. ATP düzeyleri luciferase-luciferin kiti ile belirlendi ve protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. ATP tsay kiti ortak çözümler, hücreler veya dokularda ATP düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir. Bu kit floresan oluşturmak için floresan tarafından katalize firefly luciferase dayanmaktadır, ATP enerji sağlamak için gerekli olduğunda. Ateş böceği luciferase ve floresan aşırı olduğunda, belirli bir konsantrasyon aralığında, floresan üretimi ATP konsantrasyonu ile orantılıdır. Buna ek olarak, bu kit özel ATP kemilüminesans optimize etmek için tasarlanmıştır. ATP, en önemli enerji molekülleri olarak, hücrelerin çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerinde önemli bir rol oynar. ATP düzeylerindeki değişiklikler hücre fonksiyonundaki kusurları, özellikle mitokondriyal enerji üretimini yansıtabilir. Genellikle apoptoz altında, nekroz veya bazı toksik durumda, hücresel ATP düzeyleri azaltılmış 10. JC-1’li MP’ler teşp kiti, hücreleri, dokuları veya saflaştırılmış MDP’leri hızlı ve hassas bir şekilde tespit etmek için JC-1’i floresan sonda olarak kullanan bir kittir. Apoptozun erken teşhisi için kullanılabilir. Katyonik boya JC-1, yeşil ve kırmızı floresan oranı değişiklikleri ile gösterilen akış sitometrisi altında analiz edilebilen MMP’yi tespit etmek için kullanılan bir floresan sondadır. MMP yüksek olduğunda, JC-1 kırmızı floresan üreten bir polimer (J-agregalar) oluşturmak için mitokondri matris toplanır. MMP düşük olduğunda, JC-1 birikemez ve yeşil floresan11üreten monomer oluşturur. Yani kırmızı ve yeşil floresan oranı MMP düzeyini yansıtabilir. Hücrelerin OCR normal hücresel fonksiyonun önemli bir göstergesidir12. Mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için bir parametre olarak kabul edilir. Hücre mito stres test kiti mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerini analiz etmek için kararlı bir yöntem sağlar. Kit, hücre mitokondriyal stres testi yapmak için standart bir yöntemin yanı sıra kalite kontrol ve prediktif reaktifler sağlar. Birincil hücreler, hücre hatları, askıda hücreler ve adacıklar, nematodlar, mayalar ve izole mitokondriler de dahil olmak üzere tüm hücre türlerini tespit etmek için kullanılabilir.
OCR ölçümü, hücrelerin fizyolojik durumu veya değişiklikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Solunum taban çizgisi, proton sızıntısı, maksimal solunum, ATP cirosu ve rezerv kapasitesini saptamak için hücre dışı akı analizörü ile belirlendi. Kısacası, OCR’nin bazal ölçümlerinden sonra, ocr ardışık olarak oligomisin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriyal oksidatif fosforilasyon uncoupler) ve antimisin A/rotenone (oksijen tüketiminin inhibitörü) ekolarak eklendikten sonra saptandı.
Hepatositlerde in vitro olarak mitokondriyal fonksiyonun saptanması için daha spesifik protokolün geliştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla, burada TEM, konfokal mikroskopi, luminometre, akış sitometrisi ve hücre dışı akı analizörü ile mitokondri hasarına bağlı yan etkilerin incelenmesinde ileride uygulama ile deneyler sokuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algılama protokolünün başarısı için kritik olan, fenotipten mekanizmaya kadar çalışma kapsamında yer alan çeşitli deneysel yöntemlerin kullanılmasıdır. Bu çalışmada DMEM’de HepG2 hücreleri penisilin ve streptomisin ve %10 fetal sığır serumu ile kültürlendi. Hücreler %40-50 birleştiğinde β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) eklenmiş ve 24 saat kuluçkaya yatırıldı. İlk olarak, temsilci OKP’lerin neden olduğu hepatositteki ultrastrüktürel değişiklikleri gösteren TEM’i kullandık, β-HCH, mitoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81573174, 81570574) tarafından desteklenmiştir; Jiangsu Eyaleti Üstün Gençlik Fonu (SBK2014010296); Çin Eğitim Bakanlığı Araştırma Projesi (213015A); Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (PAPD) Öncelikli Akademik Program Gelişimi, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Önemli Gelişimi; ve Devlet Kilit Çevre Kimyası ve Ekotoksikoloji Laboratuvarı Açık Proje Programı (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
