البروتوكول التجريبي للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد المعرضة لمبيدات الآفات أورجاكلوري
Summary
إن فهم تأثير مبيدات الآفات العضوية العضوية (OCPs) على وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد مهم في استكشاف آلية OCPs التي تسبب اضطرابات التمثيل الغذائي. تعرض هذه الورقة طرق مفصلة للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا الكبدية.
Abstract
تعرض هذه الورقة طرقًا تفصيلية للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا الكبدية لفهم أفضل سبب الاضطرابات الأيضية الناجمة عن مبيدات الآفات العضوية (OCPs) في خلايا الكبد. وقد تعرضت خلايا HepG2 إلى β-سداسي كلورو حلقي الهكسيكاني (β-HCH) لمدة 24 ساعة بجرعة مكافئة من التعرض الداخلي لدى عامة السكان. تم فحص الهيكل الفائق في خلايا الكبد عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) لإظهار أضرار الميتوكوندريا. تم تقييم وظيفة الميتوكوندريا كذلك من خلال كثافة الفلورية الميتوكوندريا، الأدينوسين 5’ثلاثي الفوسفات (ATP) مستويات، معدل استهلاك الأكسجين (OCR) وإمكانية غشاء الميتوكوندريا (MMP) في خلايا HepG2 المحتضنة مع β-HCH. لوحظت شدة الفلور الميتوكوندريا بعد أن لطخت بمسبار الفلورسنت الأخضر الميتوكوندريا مع مجهر الفلورسين. تم استخدام رد فعل لوسيفيرين-لوسيفراز لتحديد مستويات ATP. تم الكشف عن MMP بواسطة الصبغة الاتينية JC-1 وتحليلها تحت عملية استئصال السيل. تم قياس OCR مع محلل تدفق خارج الخلية. وباختصار، استخدمت هذه البروتوكولات في الكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد مع للتحقيق في أضرار الميتوكوندريا.
Introduction
آثار مبيدات الكلور العضوي (OCPs) على الصحة ، على سبيل المثال التدخل التناسلي ، والسمية المناعية ، والتغيرات الأيضية وقد سبق دراسة1،2،3. وقد مكنت طرق الكشف عن التمثيل الغذائي الخلوي ومعرفة الخلل الميتوكوندريا العلماء لفهم دور وظيفة الميتوكوندريا(أي.، مستويات الميتوكوندريا STAT3، اللاكتات، البيروفات، اللاكتات إلى بيروفات نسبة، انزيم Q10، تسرب البروتون الميتوكوندريا، الحيوية، النشوء الحيوي، وديناميات) في مجالات مثل الشيخوخة والسمنة والسكري، وظيفة القلب والأوعية الدموية، والسرطان، والسمية السلامة4،,5،,6،,7. في هذه الورقة، نحن وصف الأساليب على تقييم الخلل الميتوكوندريا الناجمة عن OCPs.
لقد قمنا بكشف خلايا HepG2 إلى β-سداسي كلورو سيكلوهيكسان (β-HCH)، وهو عبارة عن أحد الـ OCPs ممثل، لـ 24 ساعة بجرعة تعادل التعرض الداخلي للإنسان. أولاً، تم تطبيق TEM لمراقبة البنية الفائقة لل الكبد، مثل النوى، الميتوكوندريا والوريتيكولوم إندوبلاسميك8. مقارنة مع المجاهر العادية، TEM تمكن من استكشاف 2D و 3D فائقة البنية من الخلايا ومكونات الخلايا (خطوط الخلايا أو الأنسجة)، والمورفولوجيا، التركيب الكيميائي، فضلا عن وظيفة المواد الطبيعية أو الاصطناعية التي تلعب دورا محوريا في العلوم والتكنولوجيا الحديثة. تم تقييم وظيفة الميتوكوندريا كذلك من خلال كثافة الفلور الميتوكوندريا، ومستويات الأدينوسين 5 ‘ثلاثي الفوسفات (ATP)، ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) وإمكانية غشاء الميتوكوندريا (MMP) في خلايا HepG2 المحتضنة مع β-HCH. الميتو تعقب الأخضر هو مسبار الفلورسنت الأخضر الميتوكوندريا التي يمكن استخدامها لالتلوين الفلورسنت الخلية الحية الخاصة. وقد لطخت الميتوكوندريا في الكبد من قبل الميتو تعقب الحل الأخضر وشدة الفلورية الميتوكوندريا، وعدد ونمط لوحظ مع المجهريةconfocal 9. يمكن استخدام مسبار الفلورسنت الأخضر الميتوكوندريا لطخة الخلايا الحية. بالمقارنة مع رودامين 123 أو JC-1، الميتوكوندريا الأخضر الفلورسنت التحقيق لا يعتمد على احتمال غشاء الميتوكوندريا للتلوين الميتوكوندريا. تم تحديد مستويات ATP من قبل مجموعة لوسيفيراز لوسيفرين وتطبيعها حسب تركيز البروتين. يمكن استخدام مجموعة المقايسة ATP للكشف عن مستويات ATP في الحلول الشائعة أو الخلايا أو الأنسجة. ويستند هذا المجموعة على اليراعات luciferase حفزت من قبل الفلوريسين لتوليد الفلوريسين، عندما ATP مطلوب لتوفير الطاقة. عندما يكون اليراعات وفلوريسين مفرطين ، في نطاق تركيز معين ، يتناسب توليد الفلور مع تركيز ATP. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تم تصميم هذه المجموعة خصيصا لتحسين chemiluminescence من ATP. يلعب ATP ، باعتبارها أهم جزيئات الطاقة ، دورًا مهمًا في العمليات الفسيولوجية أو المرضية المختلفة للخلايا. التغيرات في مستويات ATP يمكن أن تعكس عيوب في وظيفة الخلية، وخاصة إنتاج الطاقة الميتوكوندريا. عادة تحت موت الخلايا المبرمج، نخر أو في بعض الدولة السامة، وانخفاض مستويات ATP الخلوية 10. MMPs مجموعة من المقايسة مع JC-1 هو مجموعة التي تستخدم JC-1 كمسبار الفلورسنت للكشف عن الخلايا والأنسجة أو MMPs تنقية بسرعة وبحساسية. ويمكن استخدامه للكشف المبكر عن موت الخلايا المبرمج. الصبغة الواتية JC-1 هو مسبار فلوري يستخدم للكشف عن MMP التي يمكن تحليلها تحت قياس التدفق الضوئي المشار إليه من خلال التغيرات في نسبة الفلورس الخضراء والأحمر. عندما يكون MMP عالية، JC-1 يتم تجميعها في مصفوفة الميتوكوندريا لتشكيل البوليمر (J-المجاميع)، التي تنتج الفلورس الأحمر. عندما يكون MMP منخفضًا ، لا يمكن لـ JC-1 أن يتراكم ، ويشكل مونومر الذي ينتج الفلورس الخضراء11. وبالتالي فإن نسبة الفلورس الأحمر والأخضر يمكن أن تعكس مستوى MMP. OCR من الخلايا هو مؤشر حاسم من وظيفة الخلوية العادية12. ويعتبر بمثابة معلمة للبحث وظيفة الميتوكوندريا. خلية ميتو اختبار مجموعة يوفر طريقة مستقرة لتحليل المعلمات الرئيسية من وظيفة الميتوكوندريا. توفر المجموعة مراقبة الجودة والكواشف التنبؤية بالإضافة إلى طريقة قياسية لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا الخلية. ويمكن استخدامه للكشف عن جميع أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية، وخطوط الخلايا، والخلايا المعلقة، وأيضاً بالنسبة إلى الجزر الصغيرة والنيماتودا والخمائر والميتوكوندريا المعزولة.
يمكن أن يوفر قياس OCR رؤية قيمة للحالة الفسيولوجية أو التعديلات في الخلايا. تم تحديدها مع محلل تدفق خارج الخلية للكشف عن خط الأساس التنفس، تسرب البروتون، التنفسي القصوى، دوران ATP والقدرة الاحتياطية. وباختصار، بعد القياسات الأساسية لل OCR، تم الكشف عن OCR بعد أن أضاف بشكل متتابع إلى oligomycin (ATP رنمر)، FCCP (الميتوكوندريا الأكسدة الفوسفور uncoupler) و antimycin A/rotenone (مثبط لاستهلاك الأكسجين) في البئر.
في محاولة لتسهيل تطوير بروتوكول أكثر تحديدا للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد في المختبر، ونحن نقدم هنا تجارب من قبل TEM، المجهري confocal، مضيئة، تدفق الخلايا وتحليل تدفق خارج الخلية مع التطبيق في المستقبل في دراسة الضرر الميتوكوندريا النتائج السلبية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
10- ومن الأهمية بمكان لنجاح بروتوكول الكشف استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية التي تمت تغطيتها في الدراسة من النمط الظاهري إلى الآلية. في هذه الدراسة، كانت خلايا HepG2 المستزرعة في DMEM مع البنسلين وstreptomycin و 10٪ مصل الأبقار الجنين. عندما وصلت الخلايا إلى التقاء 40-50٪ ، تمت إضافة HCH -β (0 ، 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 81573174، 81570574)؛ صندوق الشباب المتميز لمقاطعة جيانغسو (SBK2014010296)؛ المشروع البحثي لوزارة التعليم الصينية (213015A)؛ :: تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو، وهو التطور الرئيسي الرئيسي لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو؛ وبرنامج المشروع المفتوح للمختبر الرئيسي للدولة للكيمياء البيئية وعلم السموم الإيكولوجية (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
