Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定
Summary
我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ セクレターゼ酵素を定量化する設計されています。
Abstract
異なる基板の γ セクレターゼ胸の谷間を定量化するセルベースのレポーター遺伝子アッセイのペアを開発しました。本稿では、アプリ C99 のノッチ、Gal4 プロモーターに駆動されるホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して γ セクレターゼによる胸の谷間を監視するために使用可能性があります手順について説明します。これらの試金は安定株 Gal4 駆動ルシフェラーゼ レポーター遺伝子とアプリ (アプリ C99; のいずれか Gal4/VP16 タグ C 末端フラグメント HEK293 細胞が共同で設立されました。Cg 基本セルの場合)、または、Gal4 VP16 タグ付けのノッチ-ΔE (NΔE;NG のセル)。並列でこれらのレポーターの試金を使用して、我々 はことを示している ErbB2 阻害剤、CL 387,785、優先的に cg 基本セルでアプリ C99 が NG の細胞でない NΔE γ-セクレターゼ胸の谷間を抑制できます。CL-387,785 で処理する CG と NG の細胞によって展示差動応答 γ セクレターゼ変調器の最寄りの特性を表し、これらの応答は、γ-セクレターゼ部による抑制パンとは対照的。私たちの研究は、携帯電話のコンテキストで異なる基板上に向けた γ セクレターゼ活動を鑑別できることの直接の証拠を提供します。これらの新しいアッセイしたがって改善の AD 治療の薬剤開発に便利なツールがあります。
Introduction
アミロイド β (a β) のオリゴマー フォーム1アルツハイマー病 (AD) 患者の脳の神経変性の主な原因と考えられています。Β-セクレターゼによって最初放置、γ-セクレターゼ2a β ペプチドがアミロイド前駆体タンパク質 (APP) の段階的な胸の谷間によって生成されます。過去 10 年間で AD の治療に対する治療のアプローチが a β の生産3の防止に焦点を当てた。研究の大半は、どちらかアプリの γ セクレターゼ胸の谷間を排除でき、a β の生産または β-及び/又は γ-セクレターゼ活動4の抑制により減少する α セクレターゼ活性の増強に焦点を当てています。残念ながら、β と γ セクレターゼ5,6の他の生理学的な基板の機能の干渉のため、やむを得ない副作用で β または γ セクレターゼ結果の非選択的阻害。Γ セクレターゼ阻害剤に関する最近の研究はノッチ7 の重要な γ セクレターゼによる処理にはほとんど影響を発揮しながら a β の生産を調節することができます化学および遺伝の変調器の数の発見を報告しています。 ,8,9,10、11,12, しかし、成功した治療法はまだ開発されていません。したがって、さらに体系的な画面が選択的に γ セクレターゼ仲介アプリ処理を調節する新規の遺伝物質と化学修飾子を発見する保証されます。
Γ-セクレターゼは、90 以上の異なる膜アンカー型蛋白質を裂くこと知られています。これらの基板間で切り込み、その活動は細胞の運命決定や分化開発13にとって重要です。ノッチに影響を及ぼす処理が γ セクレターゼ阻害剤の最小限に抑えるノッチ関連副作用のため不可欠になります γ セクレターゼ触媒のアプリがない場合は処理を選択的に調節することと、この選択性が主な要因と考えられています。広告の慢性の処置のための潜在的な γ セクレターゼ変調器の生物学的有効性を定めます。Arylsulfonamide 誘導体、GSI 953 (begacestat) や BMS-708163 (avagacestat)、γ-セクレターゼ14,15の強力かつ選択的な阻害が確認されたことなどの数がありました。以前の研究は、ゼブラフィッシュ16を使用して体内の検証との組み合わせで定量的な ELISA アッセイを使用してアプリやノッチの γ セクレターゼ胸の谷間の差分の抑制を観察できることを示しています。さらに、γ-セクレターゼ アプリとノッチの17,18への潜在的な基質選択性に対処するため細胞ベースのアッセイのパラダイムが確立されています。ここ、これらに類似のプロトコルを使用して、我々 は最近 (D) の新規クラスを発見した-leucinamides 強力ノッチ温存選択性19アプリの γ セクレターゼ胸の谷間を調節します。一緒に、研究のこのコレクションは、検証のための γ セクレターゼの基質選択性/可用性が化学変調と実験的検証の対象とすることができます概念をサポートを提供します。ただし、これらのアッセイのプラットフォームは、しばしば比較的低スループット リードアウトと創薬プログラムの産業基準を満たしていない可能性が労働集約的なアプローチに依存します。
最近、2 つの異なる基板、アプリ (アプリ C99) の 99 アミノ酸 C 末端フラグメントと、細胞外へ γ セクレターゼの活性を決定する定量的ルシフェラーゼの細胞を用いたレポータージーンアッセイを生成しました。ドメイン削除ノッチ ペプチド (NΔE)。アプリ C99 と NΔE の両方は、さまざまな試金で γ セクレターゼの直接基板として広く使用されています。アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に均一で一貫性のあるルシフェラーゼ レポータージーンアッセイを生成するには、恒常 Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター (を表す 1 つの安定 HEK 細胞ライン (CG) を生成しました。Gal4-Luc)、Gal4 VP16 タグ付きアプリ C99 融合蛋白質 (C99 GV)。さらに、我々 は恒常 Gal4 リュックと Gal4 VP16 タグ付き NΔE (NΔE-GV) を表現する別の安定した HEK 細胞ライン (NG) が生成されます。これらの新規基質特異的 γ-セクレターゼの試金を使用して、我々 は今を定量化し、異なる基板 (cg 基本セルでアプリ-C99) または NG 細胞における NΔE に向かって γ セクレターゼの活性を区別する方法を提供します。さらに、基質特異的 γ-セクレターゼの試金は高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを助長すること設計されました。これらの新しく生成された γ-セクレターゼ試新規 γ-セクレターゼ変調器次世代治療のため望ましくないノッチ阻害を引き起こす事なく a β の生産を抑制することで認知機能を向上させることの発見の道を開くこと広告。
Protocol
Representative Results
Discussion
広告 aducanumab 免疫療法のフェーズ 1 b 試験の有望な結果は広告22の病因における a β の重要な役割を定着させたし、抗 a β のアプローチがまだアンチ広告薬の開発のための実行可能な戦略であることを示唆しています。ここでは、アプリ C99 とホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して NΔE の γ セクレターゼ触媒分解を定量化するため細胞に基づく試金について…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は携帯研究所・生体生物学中央研究院、中核施設のテクニカル サポートをありがちましょう。本研究は、科学技術、台湾 (Y. f. で 103-2320-B-001-016-MY3 が最も省に支えられL.)、バイオ医薬開発-プラットフォームの軸を支える技術の橋渡しの革新のためのプログラム (Y. f. l. に NP7) 方式と中央研究院 (義-f. l.) に。
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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