El cerebelo de ratón como modelo para el estudio de la neurogénesis embrionaria

Todos los trabajos de animales se realizan según UK Home Office y directrices éticas locales. 1. Resumen de pasos y tiempo Realizar cruzamientos programado de ratones adultos de una cepa adecuada responder a la pregunta biológica bajo investigación para obtener embarazos de 9,5-e13.5 día embrionario (e); requiere 12-15 días. Opcionalmente, preparar 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) / solución 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) y realizar la inyección (Protocolo, artículo 2); requiere ~ 1 h al día antes o el día de aislamiento de embriones, dependiendo de la longitud deseada de etiquetado EdU/BrdU. Realizar disección de embriones aislamiento y cerebelo (Protocolo, artículo 3); requiere ~ 10 min/embrión. Realizar inmunofluorescencia wholemount etiquetado (Protocolo de la sección 4); requiere de 3 días. Sección con un vibratome y cabo flotante inmunofluorescencia sección etiquetado (artículo 4 del Protocolo): requiere 2 días. Sección utilizando un criostato y realizar inmunofluorescencia etiquetado de cryosections (Protocolo, artículo 5); requiere de 2 días. 2. inyectar el ratón hembra embarazado con BrdU o EdU (opcional) Disolver BrdU o EdU en tampón de fosfato estéril salino (PBS) a concentraciones de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente.PRECAUCIÓN: BrdU y EdU son tóxicos; usar protección adecuada. Pesar el ratón embarazado y calcular el volumen de solución BrdU o EdU que debe administrarse para llegar a 100 mg/kg BrdU o 5 mg/kg EdU. Inyectar la solución BrdU o EdU por vía intraperitoneal o 1 h o 1 día antes de recoger los embriones, dependiendo de la longitud necesaria de la etiqueta.Nota: Etiquetado para 1 h visualiza las células del cerebelo en fase S. Etiquetado para el día 1 visualiza la progenie de hindbrain NPCs. 3. disección de Hindbrains de e9.5 – e13.5 embriones de ratón Eutanasia de un ratón hembra embarazada tiempo usando un procedimiento éticamente aprobado en la etapa gestacional requiere (p. ej., la dislocación cervical). Utilizando unas tijeras afiladas, abrir la cavidad peritoneal y suprimir cuidadosamente el útero. Lugar del suprimido útero que contiene los embriones en un plato de plástico de 60 mm que contiene 20 mL PBS helado.Nota: No se requiere una técnica aséptica. Realizar la disección más todos usando un microscopio de disección. Utilizando el número 5 de pinzas de relojero, romper la pared del músculo uterino para exponer los embriones, liberar cada embrión por cortar el cordón umbilical y quitar el saco vitelino. Utilizando una pipeta Pasteur estéril con un agujero en todo el apertura, transferir cada embrión en un plato plástico con PBS helado. Utilizando pinzas de relojero número 55, cortar la cabeza (Figura 1E). Opcionalmente, conservan un pequeño trozo de tejido (p. ej., 1/4 de un saco vitelino o punta de la cola de aproximadamente 2 mm) para el aislamiento de ADN genómico y posterior genotipado. Utilizando pinzas de relojero número 55, suprimir el tejido que contiene el cerebelo paralelo a e inmediatamente por debajo del neuroepitelio del cerebelo para separarlo del tejido facial y del cerebro anterior (Figura 1F). Coloque el lado dorsal caudal cabeza tejido y cerebelo hacia arriba e identificar el ventrículoth 4, que está cubierto por una capa de tejido delgado (placa del techo). Cuidadosamente perforar la placa del techo utilizando pinzas de relojero número 55 (figura 1) y pelar lejos exceso de tejido con pinzas, mover rostral a lo largo de la línea media sobre el cerebro medio y luego caudalmente sobre el posterior cerebelo y médula espinal (figura 1 ); el cerebelo se expondrá ahora en una preparación de libro abierto (figura 1 H). Preparar hindbrains wholemount inmunomarcación (opción 1). Con el número 55 de pinzas de relojero, tease cuidadosamente lejos mesenchyme cabeza restante y cualquier meninges atados por un lado pial del cerebelo usando fórceps (figura 1I). Retire el midbrain y el tejido de la médula espinal (Figura 1J) para dejar sólo el tejido del cerebelo (figura 1 K).Nota: Este paso del procedimiento debe no ser seguido en e9.5 o e10.5, porque intentar hacerlo probablemente dañaría el neuroepitelio del cerebelo; por otra parte, quitando las meninges no es esencial porque el neuroepitelio del cerebelo es suficientemente fina en esta etapa para permitir la penetración eficiente de anticuerpos de inmunomarcación. Este paso debe, sin embargo, seguir de e11.5, cuando se consolida el tejido meníngeo, para mejorar la penetración del anticuerpo en el neuroepitelio del cerebelo. La disección es más fácil cuando se realiza en helada PBS (PBS limpio de uso para cada cerebelo). Preparar hindbrains vibratome y cryosectioning (opción 2) Utilizando pinzas de relojero número 55, retire el midbrain y el tejido de la médula espinal (Figura 1J).Nota: No es necesario sacar mesenchyme y meninges de hindbrains destinados a seccionar (como se muestra en la figura 1I). Hindbrains de transferencia desde el plato de plástico para tubos de fondo redondo de 2 mL con una pipeta Pasteur, aspirar todo PBS y fijar por 2 h a 4° C con suave agitación en recién descongelado formaldehído de w/v 4% disuelta en PBS.PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; usar protección adecuada. Enjuague hindbrains x 3 veces con PBS. Almacenar a 4 ° C en PBS si inmunomarcación, comienzan en 2-3 días o reemplazará PBS con 50% methanol/50% PBS durante 5 minutos antes de transferirlas al 100% metanol para un almacenaje más largo a-20° C. 4. Wholemount inmunofluorescencia Si es necesario, rehidratar hindbrains en la disminución en serie de diluciones de metanol en PBS (p. ej., 75% de metanol, metanol 50%, 25% metanol) a temperatura ambiente (RT) por 5 min y luego se transfieren a PBS.Nota: Una serie gradual de metanol es necesaria rehidratar hindbrains suavemente y garantizar la preservación de tejido apropiado. Permeabilizar hindbrains durante 30 min a 4 ° C en PBS con un 0.1% Tritón X-100 (PBT) con agitación suave. Incubar hindbrains por 1 h a 4 ° C en PBT conteniendo suero de cabra inactivadas por calor de 10% con agitación suave.Nota: Use el suero de la especie que se han planteado los anticuerpos secundarios en. Anticuerpos primarios en cabra, incubar en suero proteína cuadra, por ejemplo 5% albúmina de suero bovino en PBS o en una alternativa comercial adecuada (véase Tabla de materiales). Esto reducirá no específicos de tinción observada con frecuencia al usar anticuerpos primarios en cabra. Incubar hindbrains durante la noche a 4 ° C en PBT con 1% de suero inactivado con calor y anticuerpos primarios con agitación suave (por ejemplo, las histonas rabbit anti-phospho H3 [pHH3] diluido 1: 400).Nota: Para anticuerpos primarios en cabra, utilice PBT sin suero. Lavar las hindbrains a 4 ° C 5 x con PBT para 1 h. Incubar hindbrains durante la noche a 4 ° C en PBT conteniendo apropiados fluoróforo secundarios anticuerpos conjugados (por ejemplo, cabra anti-conejo Alexa Fluor 488) a 1: 200 en PBT dirigida contra los anticuerpos primarios utilizados. Evitar que hindbrains en la oscuridad aquí proteger fluoróforos de fotoblanqueo.Nota: Para anticuerpos primarios en cabra, utilice cabras contra fragmentos Fab de anticuerpos secundarios para reducir la tinción inespecífica. Lavar las hindbrains a 4 ° C 5 x con PBT para 1 h. Sufijo hindbrains en formaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente para la preservación a largo plazo de la Unión de anticuerpos. Enjuague dos veces en PBS. Cubrir un portaobjetos de vidrio con dos capas de cinta aislante negra y suprimir una plaza pequeña de la cinta de capas para crear un bolsillo lo suficientemente grande para un cerebelo. Transferir cada cerebelo en un bolsillo con una pipeta Pasteur, eliminar el exceso de líquido y añadir un reactivo apropiado antifade al bolsillo antes cubriendo lentamente con un cubreobjetos de vidrio para evitar burbujas de aire captura bajo el cubreobjetos. Sellar el cubreobjetos y añadir a la diapositiva con una fina capa de esmalte de uñas. Almacenar diapositivas a 4 ° C en la oscuridad hasta la adquisición de la imagen (artículo 7 del Protocolo). 5. Vibratome seccionamiento y flotantes sección inmunofluorescencia Si es necesario, rehidratar hindbrains de metanol como se describe en el paso 4.1. Insertar hindbrains en fundido 3% w/v agarosa al agua destilada.Nota: Deje la agarosa fundida se enfríe a 55° C aproximadamente brevemente antes de incrustar para evitar daños al cerebelo. Cortar secciones de cerebelo transversal con un grosor de 70 μm con un vibratome. Transferir cada sección recién cortada con un pincel en un pocillo de una placa de 24 pocillos con PBS helado. Las secciones flotantes de la etiqueta como se describe en pasos 4.2-4.7, pero modifique los pasos como sigue: lavar la flotación de las secciones a 4 ° C x 3 con PBT de 15 minutos cada uno, disminuir el tiempo de incubación para los anticuerpos secundarios a 2 h e incubar en anticuerpo secundario a TA. Opcionalmente, después de etiquetar con anticuerpos para otros epitopos como se describe en el paso 5.4, detectar núcleos de EdU+ con un EdU etiquetado kit según las instrucciones del fabricante. Incubar las secciones flotantes en la reacción cóctel durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Cerebelo lavado secciones a 4 ° C x 3 con PBT de 15 minutos cada uno. Opcionalmente, después de etiquetar para otros epitopos como se describe en el paso 5.4, detectar núcleos de BrdU+ como sigue. Incubar las secciones flotantes en ácido clorhídrico de 2 N a 37 ° C por 30 min en la oscuridad. Incubar las secciones flotantes en tampón de borato de sodio 0,1 M pH 8.5 dos veces por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad para neutralizar el ácido clorhídrico. Lávese flotante las secciones 3 x brevemente en PBS a 4 ° C. Realizar inmunofluorescencia etiquetado de BrdU como se describe en el paso 5.4. Incubar las secciones flotantes por 2 min a temperatura ambiente en 10 μg/mL 4′, diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en PBS a contratinción núcleos celulares. Postfix las secciones flotantes en formaldehído al 4% durante 15 min a TA. Lávese las secciones flotantes brevemente en PBS. Cuidadosamente transfiera secciones flotantes a un portaobjetos de vidrio con un pincel. Eliminar exceso PBS alrededor de la sección usando papel secante. Monte las secciones usando glicerol 80% en PBS y lentamente con un cubreobjetos de vidrio para evitar burbujas de aire captura. Almacenar diapositivas a 4 ° C en la oscuridad hasta la adquisición de la imagen (paso 7). 6. criostato de seccionamiento y criosección inmunofluorescencia etiquetado Si es necesario, rehidratar hindbrains de metanol como se describe en el paso 4.1. Incubar hindbrains en sacarosa 30% p/v en PBS a cryoprotect hindbrains antes de la congelación.Nota: Hindbrains están listos para congelar cuando han hundido hasta el fondo del tubo, que por lo general toma ≤ 2 h e9.5-10.5 hindbrains y 3-6 h en e11.5-13.5 hindbrains. Sumerja el hindbrains en la temperatura de corte óptico compuesto (OCT) y congelar rápidamente mediante la transferencia de moldes que contienen hindbrains en OCT a isopentano enfriado a entre-40 ° C y -50 ° C en hielo seco.Nota: Hindbrains congelados, integrados pueden almacenarse a-20 ° C a corto plazo y a largo plazo-80 ° C hasta el seccionamiento. Cortar secciones de cerebelo transversal con un grosor de 10 μm con un criostato y la transferencia a microscopio electrostático adhesivo.Nota: Cerebelo cryosections pueden almacenarse a-20 ° C a corto plazo y a largo plazo-80 ° C hasta el etiquetado. Incube los portaobjetos a TA por 15 min para secar las secciones a las diapositivas. Lavar cryosections con PBS disolver OCT y marca una barrera hidrofóbica alrededor cryosections usando una pluma PAP. Repita los pasos 5.4-5.8. Repita el paso 5.10 con un medio de montaje con base de alcohol polivinílico en lugar de glicerol. 7. adquisición de la imagen Muestras de la imagen utilizando una epifluorescente o un microscopio confocal de escaneo láser equipada con lentes adecuadas para diapositivas montado en medios acuosos y filtros ópticos adecuados para los fluoróforos utilizado para inmunomarcación. Para la imagen el cerebelo todo o una parte del cerebelo, utilizar una lente de 10 aumentos (p. ej., figura 2B); para visualizar las áreas hindbrains para la cuantificación, utilizar un 40 X magnificación (p. ej., Figura 2D) y para visualizar las células individuales, utilizar una lente con un aumento de 63 x (por ejemplo, figura 2). 8. otros métodos Siguiente paso 3.8, homogeneizar hindbrains interpretaciones para producir una suspensión unicelular por citometría de flujo aplicaciones15. Siguiente paso 3.8, homogeneizar interpretaciones hindbrains para extraer el RNA de suspensiones celulares solo para RT-qPCR (p. ej., 16).Nota: Asegúrese de que todos los reactivos y equipos se mantienen estériles y libres de Rnasa a lo largo para evitar la degradación del ARN. Siguiente paso 3.8, homogeneizar interpretaciones hindbrains para aislar NPCs y propagarlos en vitro como neuroesferas para análisis de hindbrain NPC comportamiento17.Nota: Asegúrese de que todos los reactivos y equipos se mantienen estériles para prevenir la contaminación bacteriana/micótica de desarrolló culturas.