小鼠后脑作为研究胚胎神经再生的模型

所有的动物工作都是按照英国内政部和当地的道德准则进行的。 1. 步骤和时间摘要 对交配的成年小鼠进行定时的自适应应答, 以获得胚胎日 (e) 9.5-e13.5 妊娠;需要 12-15 天。 可选, 准备 5-溴-2-脱氧 (BrdU)/5-乙炔-2 ‘-脱氧 (教育) 解决方案和执行注入 (协议部分 2);需要1小时的前一天或前一天的胚胎隔离, 取决于所需的教育/BrdU 标签的长度。 执行胚胎隔离和后脑解剖 (议定书3节);需要10分钟/胚。 执行 wholemount 免疫荧光标记 (协议4节);需要3天。 节使用 vibratome 和执行浮动部分免疫荧光标记 (协议节 4): 需要2天。 节使用低温和执行免疫荧光标记的 cryosections (协议5节);需要2天。 2. 用 BrdU 或教育注射怀孕雌性小鼠 (可选) 将无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 中的 BrdU 或教育分解为10毫克/毫升和1毫克/毫升的浓度。警告: BrdU 和教育是有毒的;穿戴适当的保护。 称量怀孕的小鼠, 并计算 BrdU 或教育解决方案的体积, 应管理达到100毫克/千克 BrdU 或5毫克/千克教育。 在采集胚胎前1小时或1天, 通过腹腔内路线注入 BrdU 或教育解决方案, 具体取决于所需的标签长度。注: 标记为 1 h 可视后脑细胞 S 阶段。标记为1天的后脑 npc 的后裔。 3. e9.5-e13.5 小鼠胚胎 Hindbrains 的解剖 安乐在规定的妊娠期 (如, 颈椎脱位) 中使用符合伦理要求的程序的定时怀孕雌性老鼠。使用锋利的剪刀, 切开腹腔和仔细切除子宫。将被切除的子宫放入含有20毫升冰冷 PBS 的60毫米的塑料碟中。注意: 不需要无菌技术。 使用解剖显微镜进行所有进一步的解剖。使用制表钳编号 5, 撕裂子宫肌壁暴露的胚胎, 释放每个胚胎通过切断脐带和删除卵黄囊。 使用一个不育的巴斯德吸管与宽孔开口, 转移每个胚胎到一个干净的塑料盘与冰冷的 PBS。 使用制表钳编号 55, 切断头部 (图 1E)。 (可选) 保留一小部分组织 (如, ¼卵黄囊或大约2毫米尾尖) 进行基因组 DNA 分离和随后的基因分型。 使用制表钳编号 55, 切除的组织包含后脑平行, 并立即低于后脑神经细胞, 以分离它从面部和前脑组织 (图 1F)。 定位后脑和尾头组织背侧, 并确定 4th心室, 这是覆盖薄组织层 (顶板)。小心刺穿屋顶板使用钟表钳编号 55 (图 1G) 和剥离多余的组织钳, 移动 rostrally 沿中线上方的中脑, 然后尾在后后脑和脊髓 (图1G);后脑现在应该在开放的书籍准备 (图 1H) 中公开。 准备 hindbrains wholemount immunolabeling (选项 1)。 使用制表钳编号 55, 小心地戏弄了其余的头部间和任何脑膜连接到脑膜一侧的后脑使用钳 (图 1I)。取出中脑和脊髓组织 (图 1J) 只留下后脑组织 (图 1K)。注意: 此步骤不应在 e9.5 或 e10.5 中遵循, 因为尝试这样做可能会损坏后脑神经细胞;此外, 去除脑膜是不必要的, 因为后脑神经细胞是足够薄, 在这个阶段, 以允许有效地渗透抗体 immunolabeling。然而, 这一步应该, 从 e11.5 开始, 当脑膜组织巩固, 以提高抗体渗透到后脑神经细胞。解剖是最简单的, 当在冰冷的 pbs (使用清洁 pbs 为每个后脑)。 准备 hindbrains vibratome 和 cryosectioning (选项 2) 使用制表钳编号 55, 取出中脑和脊髓组织 (图 1J)。注意: 不需要删除用于剖切的 hindbrains 的间和脑膜 (如图 1I所示)。 使用巴斯德吸管将 hindbrains 从塑料盘转移到圆形底2毫升的管子, 在 pbs 中溶解4% 瓦/v 甲醛, 并在4° c 下用温和搅拌法固定2小时。注意: 甲醛是有毒的;穿戴适当的保护。 用 PBS 冲洗 hindbrains 3x 次。如果 immunolabeling 将在2-3 天内开始在4° c 或更换 pbs 与 50% methanol/50%pbs 在5分钟之前转移到100% 甲醇为更长的存贮在-20° c. 4. Wholemount 免疫荧光 如果需要, 水化 hindbrains 在 pbs (例如, 75% 甲醇, 50% 甲醇, 25% 甲醇) 在室温下连续5分钟, 然后转到 pbs, 以降低稀释的甲醇。注: 需要用分级的甲醇来轻轻水化 hindbrains, 确保适当的组织保存。 Permeabilize hindbrains 为30分钟, 在4° c 的 PBS 中含有0.1% 的海卫 X-100 (PBT) 与温和的鼓动。 在4° c 下, 在含有10% 热灭活山羊血清的 PBT 中孵育 hindbrains, 并温和搅拌。注意: 使用宿主物种中的血清来培养二次抗体。对于在山羊体内饲养的主要抗体, 在无血清蛋白块中孵育, 例如 PBS 中的5% 牛血清白蛋白或合适的商业替代品 (参见材料表)。这将减少非特异染色经常观察时使用的主要抗体在山羊饲养。 在4° c 夜间孵育 hindbrains, 含有1% 热灭活血清和温和躁动的初级抗体 (例如, 兔抗磷组蛋白 H3 [pHH3] 稀释 1:400)。注意: 对于山羊的主要抗体, 使用无血清 PBT。 hindbrains 在4° c 5x 时用 PBT 清洗1小时。 在4° c 的情况下, 在含有适当荧光共轭二级抗体 (例如, 山羊抗兔 Alexa 氟 488) 的 pbt 中孵育 hindbrains, 在1:200 的 pbt 中针对所用的主要抗体。让 hindbrains 在黑暗中从这里保护荧光免受漂白。注意: 对于山羊的主要抗体, 使用抗山羊的二次抗体片段来减少非特异性染色。 hindbrains 在4° c 5x 时用 PBT 清洗1小时。 将 PBS 中的 hindbrains 在4% 的甲醛中进行15分钟的后缀, 用于长期保存抗体结合。在 PBS 中简单冲洗两次。 用两层黑色电子胶带盖上玻璃显微镜, 并将小方块从层状胶带上剪下, 形成一个大到足以容纳一后脑的口袋。 将每个后脑到一个口袋里, 用巴斯德吸管, 除去多余的液体, 然后在口袋里放上适当的 antifade 试剂, 然后用玻璃片, 以避免在片下捕捉气泡。密封的片和贴在幻灯片上薄薄一层指甲油。存储在4° c 的幻灯片在黑暗中, 直到图像获取 (协议部分 7)。 5. Vibratome 切片和漂浮部分免疫荧光 如有需要, 水化 hindbrains 的甲醇, 如步骤4.1 所述。 嵌入 hindbrains 在熔融3% 瓦特/v 琼脂糖在蒸馏水中制备。注: 在嵌入前, 允许熔融琼脂糖冷却至近似 c, 以防热损伤后脑。 使用 vibratome 将横向后脑剖面切割为70µm 的厚度。将每个刚切割的部分与一支画笔放入一个装有冰冷 PBS 的24井板的井中。 按步骤 4.2-4.7 中的说明对浮动剖面进行标记, 但请按如下方式修改步骤: 在4° c 3x 处用 PBT 洗涤漂浮部分, 每15分钟, 减少二次抗体的潜伏期为 2 h, 并在 RT 的二级抗体中孵育。 (可选) 在用步骤5.4 所描述的其他表位的抗体标记后, 根据制造商的说明检测教育+细胞核。在37° c 的黑暗中孵育反应鸡尾酒中的漂浮部分30分钟。在4° c 3x 时, 用 PBT 清洗后脑部分, 每次15分钟。 (可选) 在标记为步骤5.4 中所述的其他表位后, 检测 BrdU 的+核如下。 在黑暗中孵育 2 N 盐酸在37° c 的浮动剖面30分钟。 在0.1 米硼酸钠缓冲液中孵育浮动剖面, 在黑暗中每两次在室温下为5分钟, 以中和盐酸。 在4° c 的 PBS 中简单地洗涤漂浮的部分3x。 如步骤5.4 所述, 对 BrdU 执行免疫荧光标记。 在 PBS 的10µg/毫升 4 ‘, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 中孵育2分钟的漂浮部分, 在 counterstain 细胞核中进行。 在 RT 中将4% 甲醛的浮动部分后缀为15分钟。 在 PBS 中简要地洗涤浮动部分。使用画笔小心地将浮动剖面转移到玻璃显微镜幻灯片上。用吸印迹纸或纸巾把多余的 PBS 拖到这一节。 在 PBS 中使用80% 的甘油, 用玻璃片慢慢盖住, 避免气泡。存储在4° c 的幻灯片在黑暗中, 直到图像采集 (步骤 7)。 6. 低温切片和 Cryosection 免疫荧光标记 如有需要, 水化 hindbrains 的甲醇, 如步骤4.1 所述。 孵育 hindbrains 在30% 瓦特/v 蔗糖在 PBS cryoprotect hindbrains 前冷冻。注: Hindbrains 已准备好冻结时, 他们已经沉没到底部的管, 这通常采取≤ 2 h 为 e9.5-10.5 Hindbrains 和3-6 小时 e11.5-13.5 Hindbrains。 在光学切削温度化合物 (oct) 中浸入 hindbrains, 通过将含有 hindbrains 的模具转移到戊冷却至-40 ° c 至-50 ° c 的干冰上, 快速冻结。注: 冷冻后, 嵌入的 hindbrains 可贮存在-20 ° c 的短时和-80 度的长期, 直到切片。 使用低温和转移到静电胶显微镜幻灯片, 将横向后脑剖面切割成厚度为10µm。注: 后脑 cryosections 可储存在-20 ° c 的短期和-80 ° c 长期, 直到标签。 在 RT 中孵育幻灯片15分钟至干燥部分到幻灯片。用 PBS 笔冲洗 cryosections, 以溶解 OCT 并在 cryosections 周围标记疏水屏障。重复步骤 5.4-5.8。 重复步骤5.10 使用聚乙烯醇为基础的安装介质代替甘油。 7. 图像采集 图像样本使用 epifluorescent 或共焦激光扫描显微镜, 配有适合于水介质安装的幻灯片和适合用于 immunolabeling 荧光的光学过滤器的透镜。 要对整个后脑或后脑部分进行图像处理, 请使用镜头进行10x 放大 (例如,图 2B);要可视化 hindbrains 区域以进行量化, 请使用40X 放大倍数 (例如,图 2D), 并可视化单个单元格, 使用带有63x 放大倍数的镜头 (如,数字 2C)。 8. 替代方法 在步骤3.8 之后, 质不固定 hindbrains 为流式细胞仪应用程序生成单个单元悬浮,15。 下面的步骤 3.8, 质不固定的 hindbrains 提取 RNA 从单细胞悬浮为RT qPCR (例如, 16)。注意: 确保所有的试剂和设备都保持无菌和无核糖核酸, 以防止 RNA 的降解。 下面的步骤 3.8, 质不固定的 hindbrains 孤立 npc 和传播他们在体外作为球分析后脑 npc 行为17。注意: 确保所有的试剂和设备保持不育, 以防止干细胞文化的细菌/真菌污染。